ADN-magnétoscopie liaison analyse par diffusion de la lumière dynamique et électrophorèse

Summary

Ce protocole décrit la synthèse de particules magnétiques et évaluation de leurs propriétés de liaison à l’ADN par l’intermédiaire de diffusion de la lumière dynamique et électrophorétique. Cette méthode met l’accent sur la surveillance des changements dans la taille des particules, leur polydispersité et major de potentiel zêta de surface de particules qui jouent rôle dans la fixation des matières telles que l’ADN.

Abstract

Isolement de l’ADN à l’aide de particules magnétiques est un domaine de grande importance dans la recherche de biotechnologie et biologie moléculaire. Ce protocole décrit l’évaluation de particules magnétiques ADN liaison via la diffusion de la lumière dynamique (DLS) et diffusion de la lumière électrophorétique (ELS). Analyse par DLS fournit des renseignements précieux sur les propriétés physico-chimiques des particules dont la taille des particules et polydispersité potentiel zêta. Ce dernier décrit la charge de surface de la particule qui joue le rôle majeur dans la liaison électrostatique de matériaux tels que de l’ADN. Ici, une analyse comparative exploite trois modifications chimiques des nanoparticules et de microparticules et de leurs effets sur l’attache d’ADN et d’élution. Modifications chimiques de ramifié polyéthylènimine, triéthoxysilane (3-aminopropyl) et de l’orthosilicate de tétraéthyle sont l’objet d’une enquête. Puisque l’ADN montre une charge négative, il est prévu que potentiel zêta de surface de la particule diminue lors de la liaison de l’ADN. Formant des grappes devrait également affecter la taille des particules. Afin d’étudier l’efficacité de ces particules dans l’isolement et l’élution de l’ADN, les particules sont mélangés avec de l’ADN dans pH faible (~ 6), force ionique élevée et environnement de la déshydratation. Les particules sont lavés sur aimant et ensuite l’ADN est éluée par tampon Tris-HCl (pH = 8). Nombre de copies d’ADN est estimée à l’aide de la PCR quantitative (PCR). Potentiel zêta, granulométrie, polydispersité et données quantitatives de PCR sont évaluées et comparées. DLS est un perspicace et méthode d’analyse qui ajoute une nouvelle perspective au processus de projection de particules pour l’isolement de l’ADN.

Introduction

Isolement d’ADN est une des étapes plus essentiels en biologie moléculaire. Le développement de méthodes d’extraction des acides nucléiques a grand impact sur les domaines émergents de la génomique métagénomique, épigénétique et transcriptomique. Il y a un large éventail d’applications biotechnologiques pour l’isolement de l’ADN y compris médicale (médecine légale/diagnostic tools et biomarqueurs pronostiques) et applications pour l’environnement (biodiversité métagénomique, prévalence de l’agent pathogène et surveillance). Il y a eu une demande croissante de purifier et d’isoler l’ADN de différents matériaux et à des échelles différentes telles que sang, urine, sol, bois et autres types d’échantillons. ^{1 , 2 , 3 , 4}

Nano et micro-particules sont aptes au sectionnement de l’ADN en raison de leur grande surface et en particulier lorsqu’ils peuvent être immobilisés par un champ magnétique. Propriétés physico-chimiques des particules, comme la taille ou la charge, peuvent grandement influencer leur capacité à fixer des cibles de biomolécules. ⁵ afin de renforcer la liaison des biomolécules et de stabiliser les particules, différentes modifications chimiques (revêtements de surface) peuvent être utilisées. Les nombreuses stratégies différentes pour la liaison sont classés selon les interactions covalentes et non covalents. ⁶ la taille des particules affecte directement leurs propriétés d’aimantation, considérant que la composition des particules peut être adaptée par l’incorporation de matériaux métalliques, alliage ou autres susceptibles d’influencer sa densité, la porosité et la surface. ⁷ il n’y aucun moyen fiable pour mesurer la charge de surface des petites particules. Au lieu de cela, le potentiel électrique sur le plan de glissement (certaine distance de la surface des nanoparticules) peut être mesuré. ⁸ cette valeur s’appelle zeta potentiels et c’est un outil puissant qui est habituellement utilisé pour l’évaluation de la stabilité au moyen de microparticules et de nano – par l’intermédiaire de listes de distribution. ⁹ étant donné que sa valeur dépend non seulement du pH et de la force ionique du milieu dispersif, mais également sur les caractéristiques de surface des particules, il peut s’avérer les changements dans cette surface causée par l’interaction entre les les particules et la molécule d’intérêt. ¹⁰

En revanche, structure de l’ADN sous conditions déshydratés (ADN-ADN A formule) expositions conformations compactée qui facilitent sa précipitation (agrégation) comparativement à couramment survenant forme B-ADN. Électrostatique (ionique et liaison hydrogène) sont les principales forces qui contrôle la liaison d’ADN à d’autres matériaux en raison de leur encombrement stérique accessible phosphate et azote bases (surtout guanine). ^{7 , 10}

Dans cet ouvrage, trois modifications chimiques représentante des nanoparticules magnétiques et les microparticules sont analysées (Figure 1 a). La méthode de synthèse et de la modification chimique des nanoparticules et de microparticules sont décrite. Une solution de liaison, qui accorde aux principes théoriques de la précipitation de l’ADN (pH, force ionique et la déshydratation), sert à évaluer l’élution et la fixation à l’ADN. PCR quantitative est utilisée pour évaluer l’efficacité d’élution de l’ADN des nanoparticules représentatifs et microparticules (Figure 1 b). La taille des particules, l’indice de polydispersité et potentiel zêta sont des paramètres importants qui sont utilisées pour visualiser les modifications physico-chimiques qui se produisent sur la surface des particules (Figure 1). Il est important de mettre l’accent sur la caractérisation chimique de la surface de particules magnétiques. Alors que cette étape était au-delà de la portée du présent protocole, plusieurs techniques modernes peuvent être appliquées pour étudier l’efficacité de modifications chimiques. ^{11 , 12 , 13 , 14} spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) peut être utilisée pour évaluer le spectre infrarouge de la surface de la particule et la comparer au spectre de modificateurs chimiques libres. Spectrométrie de photoélectrons (XPS) est une autre technique qui peut être utilisée pour identifier la composition élémentaire de la surface du matériau. Autres méthodes spectroscopiques et microscopiques et électrochimiques peuvent servir à faire la lumière sur la qualité de la synthèse de la particule. Ce travail met en évidence une nouvelle perspective à l’analyse des interactions ADN-magnétiques de particules par l’intermédiaire de listes de distribution.

Protocol

1. synthèse de nanoparticules magnétiques synthèse de nanoparticules magnétiques stabilisé avec du citrate (MNPs) Ajouter 20 mmol de FeCl 3 ∙ 6 H 2 O (5,406 g) et 10 mmol de FeCl 2 ∙ 4 H 2 O (1,988 g) dans 20 mL d’eau bidistillée désoxygéné (ddd eau). Remuez obtenu solution vigoureusement dans le bécher sous atmosphère de 2 N à l’aide d’un agitateur mécanique jusqu’à l’obtention d’une solution tr…

Representative Results

En utilisant le protocole décrit ici pour synthèse chimique et la modification des particules magnétiques, six des particules magnétiques ont été synthétisés et analysés pour fixation à l’ADN. Un résumé de l’analyse est indiqué dans le tableau 1. En comparant la taille des particules dans l’eau et en solution de liaison, il est clair que toutes les particules agrégées dans solution de liaison par des plis de 2-22. Certaines particules plus regroupées…

Discussion

Dans le présent protocole, les principes théoriques qui expliquent la liaison de l’ADN aux particules magnétiques par l’intermédiaire de potentiel zêta étaient sous la question. Le protocole décrit la synthèse et la modification de nanoparticules magnétiques et de microparticules. Procédé de préparation de la solution de contrôle et de la liaison ADN sont également décrites. Deux stratégies sont indiqués ici pour le dépistage des interactions ADN-particules : approches PCR quantitative et listes de…

Materials

Iron(III) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	207926	Magnetic particle synthesis
Iron(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	380024	Magnetic particle synthesis
Iron(II) sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	F8263	Magnetic particle synthesis
Acetone	Penta	10060-11000	Magnetic particle synthesis
Sodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	W302600	Magnetic particle synthesis
Tetraethyl orthosilicate	Sigma-Aldrich	131903	Magnetic particle synthesis
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140	Magnetic particle synthesis
Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000	Sigma-Aldrich	408727	Magnetic particle synthesis
Ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldrich	221228-M	Magnetic particle synthesis
Ethanol	Penta	71250-11000	Magnetic particle synthesis
Potassium nitrate	Sigma-Aldrich	P6083	Magnetic particle synthesis
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	1.05012	Magnetic particle synthesis
ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa)	Spectrum labs	G235063	Magnetic particle synthesis
Overhead Stirrer	witeg Labortechnik GmbH	DH.WOS01035	Magnetic particle synthesis
Waterbath	Memmert GmbH + Co.	84198998	Magnetic particle synthesis
Sonicator	Bandelin	795	Magnetic particle synthesis
BRAND UV cuvette micro	Sigma-Aldrich	BR759200-100EA	Cuvette for size measurement
BRAND cap for UV-cuvette micro	Sigma-Aldrich	BR759240-100EA	Cuvette caps for size measurement
Folded Capillary Zeta Cell	Malvern	DTS1070	Cuvette for zeta potential measurement
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	Device for measurement of size and zeta potential
Infinite 200 PRO NanoQuant instrument	Tecan	396 227 V1.0, 04-2010	device for measurement of DNA concentration
SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit	Sigma-Aldrich	QR0100	PCR kit
Mastercycler pro S instrument	Eppendorf	6325 000.013	Thermocycler
MinElute kit	Qiagen	28004	DNA purification kit
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S7670	DNA binding