Spettrometria di massa tandem
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Descripción
Nella spettrometria di massa tandem una biomolecola di interesse viene isolata da un campione biologico e quindi frammentata in più subunità per aiutare a chiarire la sua composizione e sequenza. Ciò si ottiene avendo spettrometri di massa in serie. Il primo spettrometro ionizza un campione e ioni filtra di uno specifico rapporto massa/carica. Gli ioni filtrati vengono quindi frammentati e passati a un secondo spettrometro di massa dove vengono analizzati i frammenti.
Questo video introduce i principi della spettrometria di massa tandem, compresi i metodi di selezione e dissociazione massa-rapporto. Viene inoltre mostrata una procedura generale per l’analisi di un composto biochimico utilizzando la spettrometria di massa tandem con dissociazione indotta dalla collisione. La sezione applicazioni copre il monitoraggio della reazione di selezione, la determinazione delle modifiche proteiche post-traduzione e il rilevamento dei livelli di tacrolimus nel sangue.
La spettrometria di massa tandem collega insieme più fasi della spettrometria di massa per isolare prima una biomolecola e quindi determinare aspetti della sua composizione chimica. Le biomolecole hanno strutture grandi e complesse, rendendo difficile determinare la loro composizione molecolare. La spettrometria di massa tandem seleziona una molecola di interesse che viene successivamente frammentata in più subunità, che può aiutare a chiarire la sua identificazione e sequenza. Questo video mostrerà i concetti di spettrometria di massa tandem, una procedura generale e alcuni dei suoi usi in biochimica.
La spettrometria di massa tandem inizia come un tipico strumento di specifiche di massa: con una sorgente di ioni, che converte il campione in ioni, e un analizzatore di massa, che separa gli ioni in base al loro rapporto massa-carica. Un comune analizzatore di massa, il quadrupolo, consente solo ioni con un rapporto specifico, mentre gli altri si schiantano contro le aste dell’apparato. La specie lasciata passare, chiamata ione precursore, è la biomolecola di interesse. Lo ione si muove in una cella di collisione, tipicamente un altro quadrupolo, dove l’energia viene applicata per frammentare lo ione in uno schema prevedibile.
Questi frammenti si spostano in un altro analizzatore di massa, come un tempo di volo, che separa questi “ioni prodotto”. Gli ioni prodotto vengono quindi inviati al rivelatore, come in un normale strumento MS. Nel caso di una proteina sconosciuta, lo spettro risultante contiene numerosi frammenti sovrapposti, rendendo difficile la generazione di una sequenza completa definitiva della biomolecola. Tuttavia, il modello spettrale è unico per una data proteina. Il software di analisi confronta lo spettro con un database di sequenze peptidiche note, spiegando la proteina sconosciuta dai frammenti sovrapposti.
A seconda del campione e del grado di frammentazione desiderato, sono possibili più metodi di frammentazione. I modelli di frammentazione dipendono da come l’energia viene trasferita, dalla sua quantità e da come viene distribuita attraverso lo ione precursore. L’energia può essere trasferita tramite particelle neutre, radiazioni o elettroni. Utilizzando atomi neutri, un processo chiamato dissociazione indotta da collisione o CID, si scinde principalmente al legame peptidico tra gli amminoacidi, ideale per la loro identificazione.
Ora che le basi della tecnica sono state trattate, diamo un’occhiata alla spettrometria di massa tandem CID utilizzata per studiare un componente degli involucri cellulari batterici.
Come per tutti gli esperimenti spettrometrici di massa, il primo passo è quello di ionizzare il campione. Per le biomolecole, questo viene in genere fatto con il desorbimento laser assistito da matrice o la ionizzazione elettrospray. Il segnale ione precursore viene quindi ottimizzato mediante la messa a punto dell’ottica ioica. Una volta fatto, la destinazione viene isolata e viene scelto il metodo di frammentazione, come il CID.
La forza di una tensione applicata, che accelera lo ione precursore nella cella di collisione, influisce sul grado di frammentazione. Questa tensione viene aumentata fino a quando il precursore è di circa il 10% di abbondanza rispetto allo ione prodotto più alto. Più spettri vengono acquisiti e mediati fino a raggiungere un rapporto segnale-rumore sufficiente. Il numero di scansioni necessarie dipende dall’intensità del segnale dello ione precursore originale e può variare da 3 a 300.
L’analita in questo esempio, lipide A di Escherichia coli K-12, aveva 19 frammenti principali dopo CID. La struttura generale del lipide A è ben nota, consentendo al software di ricostruire la composizione specifica dal campione.
Ora che abbiamo esaminato la procedura, diamo un’occhiata ad alcuni dei modi in cui la spettrometria di massa tandem viene utilizzata in biochimica.
Una modalità di scansione comune nella spettrometria di massa tandem è il monitoraggio della reazione selezionata o SRM. In SRM, entrambi gli analizzatori di massa sono fissati a un rapporto massa-carica selezionato, concentrandosi su specifici ioni precursore e prodotto. A causa dell’elevato grado di sensibilità di SRM, gli spettri degli standard peptidici di concentrazione nota possono essere utilizzati e confrontati con quelli dei campioni sconosciuti, consentendo di quantificare le proteine di interesse.
Le proteine sono comunemente modificate dopo la traduzione, in genere mediante l’aggiunta di gruppi funzionali come gruppi metilici, gruppi fosfato o zuccheri, noti come glicani. Questi sono importanti nei processi di segnalazione cellulare, spiegando come le cellule comunicano tra loro. Poiché la spettrometria di massa tandem frammenta le proteine in componenti più piccoli, è possibile determinare la posizione del PTM nel frammento specifico o anche in un amminoacido. Alcune modifiche, come l’acetilazione e la trimetilazione, sono difficili da differenziare per sola massa, quindi la separazione cromatografica viene eseguita prima della spettrometria di massa.
Molti analeti nel sangue del paziente si trovano a concentrazioni inferiori al limite di rilevazione per la spettrometria di massa tipica. Un altro vantaggio di SRM è che scarta tutti gli ioni di prodotto tranne uno, aumentando la sensibilità e migliorando il limite di rilevamento inferiore fino a 100 volte. In questo esempio, il farmaco immunosoppressore, tacrolimus, potrebbe essere rilevato a livelli di 1 ng / mL.
Hai appena visto il video di JoVE sulla spettrometria di massa tandem. Questo video descriveva la teoria dello strumento, andava oltre una procedura generale e spiegava alcuni dei modi in cui la tecnica viene attualmente utilizzata. Grazie per l’attenzione!
Procedimiento
Divulgaciones
Transcripción
Tandem mass spectrometry links together multiple stages of mass spectrometry to first isolate a biomolecule, and then determine aspects of its chemical makeup. Biomolecules have large, complex structures, making it difficult to determine their molecular composition. Tandem mass spectrometry selects a molecule of interest that is later fragmented into multiple subunits, which can help elucidate its identification and sequence. This video will show the concepts of tandem mass spectrometry, a general procedure, and some of its uses in biochemistry.
Tandem mass spectrometry begins as a typical mass spec instrument: with an ion source, which converts the sample into ions, and a mass analyzer, which separates the ions based on their mass-to-charge ratio. A common mass analyzer, the quadrupole, only allows ions with a specific ratio through, while the others crash into the rods of the apparatus. The species allowed through, called the precursor ion, is the biomolecule of interest. The ion moves into a collision cell, typically another quadrupole, where energy is applied to fragment the ion in a predictable pattern.
These fragments move into another mass analyzer, such as a time-of-flight, which separates these “product ions”. The product ions are then sent to the detector, as in a normal MS instrument. In the case of an unknown protein, the resulting spectrum contains numerous overlapping fragments, making a definitive complete sequence of the biomolecule difficult to generate. However, the spectral pattern is unique for a given protein. Analysis software compares the spectrum to a database of known peptide sequences, elucidating the unknown protein from the overlapping fragments.
Depending on the sample and desired degree of fragmentation, multiple fragmentation methods are possible. Fragmentation patterns depend on how the energy is transferred, its amount, and how it is distributed through the precursor ion. Energy can be transferred via neutral particles, radiation, or electrons. Using neutral atoms, a process called collision-induced dissociation or CID, primarily cleaves at the peptide bond between the amino acids, ideal for their identification.
Now that the basics of the technique have been covered, let’s look at CID tandem mass spectrometry being used to study a component of bacterial cell envelopes.
As with all mass spectrometric experiments, the first step is to ionize the sample. For biomolecules, this is typically done with matrix assisted laser desorption or electrospray ionization. The precursor ion signal is then optimized by tuning of the ion optics. Once done, the target is isolated and the fragmentation method is chosen, such as CID.
The strength of an applied voltage, which accelerates the precursor ion into the collision cell, affects the degree of fragmentation. This voltage is increased until the precursor is roughly 10% abundance compared to the highest product ion. Multiple spectra are acquired and averaged until a sufficient signal-to-noise ratio is achieved. The number of scans needed is dependent on the signal intensity of the original precursor ion and can range from 3 to 300.
The analyte in this example, lipid A from Escherichia coli K-12, had 19 major fragments after CID. Lipid A’s general structure is well known, allowing software to reconstruct the specific composition from the sample.
Now that we’ve looked the procedure, let’s look at some of the ways tandem mass spectrometry is used in biochemistry.
A common scanning mode in tandem mass spectrometry is selected reaction monitoring, or SRM. In SRM, both mass analyzers are fixed to a selected mass-to-charge ratio, focusing on specific precursor and product ions. Because of SRM’s high degree of sensitivity, the spectra of peptide standards of known concentration can be utilized and compared to that of the unknown samples, allowing proteins of interest to be quantified.
Proteins are commonly modified after translation, typically by the addition of functional groups such as methyl groups, phosphate groups, or sugars, known as glycans. These are important in cell signaling processes, elucidating how cells communicate with one another. Because tandem mass spectrometry fragments the proteins into smaller components, it is possible to determine the location of the PTM to the specific fragment or even an amino acid. Some modifications, such as acetylation and trimethylation, are difficult to differentiate by mass alone, so chromatographic separation is performed before the mass spectrometry.
Many analytes in patient’s blood are found at concentrations below the limit of detection for typical mass spectrometry. Another advantage of SRM is that it discards all but one product ion, increasing the sensitivity and enhancing the lower detection limit by up to 100 fold. In this example, the immunosuppressant drug, tacrolimus, could be detected at levels of 1 ng/mL.
You’ve just watched JoVE’s video on tandem mass spectrometry. This video described the theory of the instrument, went over a general procedure, and explained some of the ways the technique is currently being utilized. Thanks for watching!
