Combinando la cristallografia a raggi x con piccolo angolo x-ray Scattering per modellare le regioni non strutturate di Nsa1 da S. Cerevisiae
Summary
Questo metodo descrive la clonazione, espressione e purificazione di Nsa1 ricombinante per determinazione strutturale di cristallografia a raggi x e small-angle x-ray scattering (SAXS) ed è applicabile per l’analisi strutturale di ibrido di altre proteine che contiene sia ordinato e disordinati domini.
Abstract
Determinazione della struttura Full-Length del fattore di assemblaggio del ribosoma Nsa1 da Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) è impegnativo a causa della disordinata e proteasi labile C-terminale della proteina. Questo manoscritto descrive i metodi per purificare ricombinante Nsa1 da S. cerevisiae per l’analisi strutturale di cristallografia a raggi x sia SAXS. Cristallografia a raggi x è stato utilizzato per risolvere la struttura del dominio N-terminale WD40 ben ordinato di Nsa1, e poi SAXS è stato utilizzato per risolvere la struttura del C-terminale di Nsa1 in soluzione. Dati di scattering di soluzione è stato raccolto da Full-Length Nsa1 in soluzione. Le ampiezze di scattering teorici sono state calcolate dalla struttura di cristallo ad alta risoluzione del dominio WD40, e poi una combinazione di corpo rigido e ab-initio modellazione ha rivelato il C-terminale di Nsa1. Attraverso questo approccio ibrido è stata ricostruita la struttura quaternaria della proteina intera. I metodi presentati qui dovrebbero essere generalmente applicabili per la determinazione strutturale di ibrido di altre proteine composta da un mix di domini strutturati e non strutturati.
Introduction
I ribosomi sono macchine di grande ribonucleoproteina che svolgono il ruolo essenziale di tradurre mRNA in proteine in tutte le cellule viventi. I ribosomi sono composti da due subunità che sono prodotte in un processo complesso chiamato ribosoma biogenesi1,2,3,4. Assemblaggio del ribosoma eucariotico si basa sull’aiuto di centinaia di assemblaggio ribosomal essenziali fattori2,3,5. Nsa1 (Nop7 associato 1) è un fattore di assemblaggio ribosoma eucariotico che sia specificatamente richiesto per la produzione delle subunità ribosomali6, ed è noto come WD-ripetizione contenente 74 (WDR74) in più alti organismi7. WDR74 è stato indicato per essere richiesto per la formazione di blastocisti in topi8e il promotore di WDR74 è frequentemente mutato in cancro cellule9. Tuttavia, la funzione e i meccanismi precisi di Nsa1/WDR74 nell’assembly del ribosoma sono ancora in gran parte sconosciuti. Per iniziare a scoprire il ruolo di Nsa1/WDR74 durante la maturazione del ribosoma eucariotico, sono state effettuate analisi strutturali multiple, compreso cristallografia a raggi x e piccolo angolo x-ray scattering (SAXS)10.
Cristallografia a raggi x, spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR), microscopia elettronica e SAXS sono tutti importanti tecniche per studiare la struttura macromolecolare. Dimensioni, forma, disponibilità e stabilità delle influenze di macromolecole il metodo di biologia strutturale per cui una particolare macromolecola sarà meglio adatto, tuttavia combinando tecniche multiple attraverso un approccio di cosiddetti “ibridi” sta diventando un strumento sempre più utile di11. In particolare la cristallografia a raggi x e SAXS sono complementari e potenti metodi per la determinazione strutturale di macromolecole12.
Cristallografia fornisce strutture atomiche ad alta risoluzione che vanno da piccole molecole a grande macchinario cellulare come il ribosoma e ha portato a numerose scoperte nella comprensione delle funzioni biologiche delle proteine e altro macromolecole13. Inoltre, progettazione di farmaci basati su struttura sfrutta la potenza delle strutture cristalline per docking molecolare di metodi computazionali, aggiungendo una dimensione critica per droga scoperta e sviluppo14. Nonostante la sua ampia applicabilità, sistemi flessibili e disordinati sono difficili da valutare di cristallografia poiché impaccamento cristallino può essere ostacolato o mappe di densità elettronica potrebbero essere incomplete o di scarsa qualità. Al contrario, SAXS è un approccio strutturale a bassa risoluzione e basati su soluzioni in grado di descrivere sistemi flessibili che vanno dal loop disordinati e stazione termini a proteine intrinsecamente disordinati12,15,16. Considerando che è compatibile con una vasta gamma di particelle di dimensioni12, SAXS può lavorare sinergico con cristallografia per ampliare la gamma di domande biologiche che possono essere affrontate dagli studi strutturali.
Nsa1 è adatto per un approccio strutturale ibrida perché contiene un dominio ben strutturato di WD40 seguito da una C-terminale funzionale, ma flessibile che non è assoggettabile a metodi di cristallografia a raggi x. Di seguito è un protocollo per la clonazione, espressione e purificazione di S. cerevisiae Nsa1 per determinazione strutturale ibrida di cristallografia a raggi x e SAXS. Questo protocollo può essere adattato per studiare le strutture di altre proteine che sono costituiti da una combinazione di regioni ordinate e disordinate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Usando questo protocollo, ricombinante Nsa1 da S. cerevisiae è stato generato per studi strutturali di cristallografia a raggi x sia SAXS. Nsa1 era ben educati in soluzione e cristallizzato in diverse forme cristalline. Durante l’ottimizzazione di questi cristalli, è stato scoperto che il C-terminale di Nsa1 era sensibile alla degradazione della proteasi. L’alta risoluzione, forma cristallina ortorombica solo potrebbe essere duplicato con varianti di troncamento di C-terminale di Nsa1, probabilmente perché il…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dati di diffrazione sono stati raccolti a sud-est squadra regionale a accesso collaborativo (SER-CAT) ID-22 e 22-BM beamlines presso Advanced Photon fonte (APS), Argonne National Laboratory. I dati SAXS è stato raccolto sulle Sibille beamline presso Advance Light Source (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Vorremmo ringraziare il personale presso la beamline Sibille per il loro aiuto con elaborazione e raccolta dei dati remota. Siamo grati alla ricerca di spettrometria di massa National Institute di Environmental Health Sciences (NIEHS) e gruppo di sostegno per aiuto per determinare i limiti del dominio della proteina. Questo lavoro è stato supportato da noi programma nazionale di Istituto di salute intramurale ricerca; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) (ZIA ES103247 a S. R. E.) e gli istituti canadesi di ricerca sanitaria (CIHR, 146626 a M.C.). Uso di APS è stata sostenuta dal dipartimento dell’energia statunitense, Office of Science, Office di base energia scienze sotto contratto n. W-31-109-ITA-38. Utilizzo di Advanced Light Source (ALS) è stata sostenuta dal direttore, Office of Science, ufficio di energia scienze di base, del US Department of Energy sotto contratto no. DE-AC02-05CH11231. Supporto aggiuntivo per la beamline Sibille SAXS deriva dal National Institute of Health project MINOS (R01GM105404) e un high-end strumentazione Grant S10OD018483. Vorremmo anche ringraziare Andrea Moon e Dr. Sara Andres per loro lettura critica di questo manoscritto.
Materials
| Molecular Cloning of Nsa1 | |||
| pMBP2 parallel vector | Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) | We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP) | |
| S. cerevisiae genomic DNA | ATCC | 204508D-5 | |
| Primers for cloning Nsa1 | |||
| SC_Nsa1_FLFw | IDT | CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT GGATAG |
|
| SC_Nsa1_FLRv | IDT | AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC AGC |
|
| SC_Nsa1_DeltaCFw | IDT | GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGG |
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| SC_Nsa1_DeltaCRv | IDT | GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTGCTTCCC |
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| Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1 | |||
| Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells | Invitrogen | C601003 | |
| pMBP- NSA1 and various truncations | Lo et al., 2017 | ||
| Selenomethionine | Molecular Dimensions | MD12-503B | |
| IPTG, Dioxane-Free | Promega | V3953 | |
| EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| Sodium Chloride | Caledon Laboratory Chemicals | 7560-1-80 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Tris Buffer, 1 M pH7.5 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-029 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 1M Imidazole, pH 8.0 | Teknova | I6980-06 | |
| Talon Affinity Resin | Clonetech | 635503 | |
| Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) | Millipore | UFC901024 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column | GE-Healthcare | 28989335 | |
| TEV Protease | Prepared by NIEHS Protein Expression Core | Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009) | |
| 4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRad | 456-8056 | |
| Crystallization, Proteolytic Screening | |||
| Crystal Screen | Hampton Research | HR2-110 | |
| Crystal Screen 2 | Hampton Research | HR2-112 | |
| Salt Rx | Hampton Research | HR2-136 | |
| Index Screen | Hampton Research | HR2-144 | |
| PEG/Ion Screen | Hampton Research | HR2-139 | |
| JCSG+ | Molecular Dimensions | MD1-37 | |
| Wizard Precipitant Synergy | Molecular Dimensions | MD15-PS-T | |
| Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates | TTP Labtech | 4150-05823 | |
| 3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR4-506 | |
| Proti-Ace Kit | Hampton Research | HR2-429 | |
| PEG 1500 | Molecular Dimensions | MD2-100-6 | |
| PEG 400 | Molecular Dimensions | MD2-100-3 | |
| HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 | Molecular Dimensions | MD2-011- | |
| Sodium Citrate tribasic | Molecular Dimensions | MD2-100-127 | |
| 22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides | Hampton Research | HR3-231 | |
| 24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) | Hampton Research | HR3-172 | |
| 18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) | Hampton Research | HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971 | |
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Magnetic Crystal Caps | Hampton Research | HR4-779 | |
| Magnetic Cryo Wand | Hampton Research | HR4-729 | |
| Cryogenic Foam Dewar | Hampton Research | HR4-673 | |
| Crystal Puck System | MiTeGen | M-CP-111-021 | |
| Full Skirt 96 well Clear Plate | VWR | 10011-228 | |
| AxyMat Sealing Mat | VWR | 10011-130 | |
| Equipment | |||
| UVEX-m | JAN Scientific, Inc. | ||
| Nanodrop Lite Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ||
| Mosquito Robot | TTP Labtech | ||
| Software/Websites | |||
| HKL2000 | Otwinoski and Minor, 1997 | ||
| Phenix | Adams et al., 2010 | ||
| Coot | Emsley et al., 2010 | ||
| ATSAS | Petoukhov et al., 2012 | https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/ | |
| Scatter | Rambo and Tainer, 2013 | ||
| Pymol | The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC. | ||
| BUNCH | Petoukhov and Svergun, 2005 | ||
| CRYSOL | Svergun et al, 1995 | ||
| PRIMUS | Konarev et al, 2003 | ||
| EOM | Tria et al, 2015 |
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