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Bioquímica

S. 酵母から Nsa1 の非構造化領域をモデル化する x 線小角散乱と x 線結晶解析を組み合わせること

Published: January 10, 2018
doi:
10.3791/56953
, ,
1Signal Transduction Laboratory, National Institutes of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services,National Institutes of Health

Summary

このメソッド小角 x 線散乱 (SAXS) x 線結晶構造解析によってクローニング、表現、および構造決定のための組換え Nsa1 の精製をについて説明し、他のタンパク質のハイブリッド構造解析の適用両方を含む注文し、無秩序なドメイン。

Abstract

リボソーム アセンブリ因子 Nsa1酵母 (出芽酵母)からのフルレングスの構造の決定は、乱れたため挑戦とプロテアーゼ活性タンパク質の C 末端。本稿では、x 線回折・小角 x 線散乱による構造解析出芽酵母から遺伝子組換え Nsa1 を浄化する方法について説明します。Nsa1 のよく整理された N 末端 WD40 ドメインの構造を解決するために x 線結晶解析を用いて、小角 x 線散乱ソリューションの Nsa1 の C 末端の構造を解決する使用だった。散乱データのソリューションは、ソリューションでフルレングスの Nsa1 から採取しました。WD40 ドメインの高分解能結晶構造から算出した理論の散乱振幅と剛体と第一原理計算モデリングの組み合わせが Nsa1 の C 末端を明らかにし。このハイブリッド アプローチを通じて、全体蛋白質の第四紀構造が再建されました。紹介した方法は、他の蛋白質の構造化および非構造化ドメインのミックスの作曲のハイブリッド構造決定の一般的に適用される必要があります。

Introduction

リボソームは、mRNA にすべての生きている細胞の蛋白質翻訳の重要な役割を果す大きいリボ核蛋白質マシンです。リボソームはリボソーム生合成1,2,3,4と呼ばれる複雑なプロセスで作り出される 2 つのサブユニットで構成されます。真核生物のリボソームの組み立ては不可欠なリボソーム アセンブリ要因2,3、5の何百もの援助に依存しています。Nsa1 (Nop7 には 1 が関連付けられている)、リボソーム大サブユニット6, の生産のために特に必要がある真核生物のリボソーム アセンブリ要因であり、WD リピートとして知られているを含む 74 (WDR74) より高い有機体7で。マウス8で胚盤胞の形成のため必要となる WDR74 が示されているし、WDR74 プロモーターよく癌細胞9で変異します。ただし、関数とリボソームの組み立ての Nsa1/WDR74 の正確なメカニズムはまだ主として知られています。まず真核生物のリボソーム成熟中に Nsa1/WDR74 の役割を明らかにするため、x 線回折・小角 x 線散乱法 (SAXS)10をなど複数の構造解析は実行されました。

X 線結晶構造解析や核磁気共鳴 (NMR) 分光法、電子顕微鏡、小角 x 線散乱は、高分子の構造を勉強してすべての重要な手法です。サイズ、形状、可用性、および安定性に適した特定の高分子が最高になる構造生物学方式高分子の影響を受けて、しかしいわゆる「ハイブリッド」アプローチを通じて複数のテクニックを組み合わせることになっている、ますます有益なツール11。特に x 線回折・小角 x 線散乱は、高分子12の構造決定のための強力かつ相補的な方法です。

結晶学小分子から、リボソームなど大規模な細胞機械装置に至るまで高解像度の原子構造を提供し、蛋白質等の生体機能の理解に多くの進歩をもたらした高分子13。さらに、構造ベース創薬の発見と開発の14に重要なディメンションを追加する計算の方法によって分子ドッキングの結晶構造のパワーを活用します。柔軟で乱れたシステムにもかかわらず、広範な応用結晶学結晶の充填が妨害されたり、電子密度マップを完了できない場合がありますので、質の悪いを評価するために挑戦しています。逆に、小角 x 線散乱、ソリューション ベースと低解像度構造アプローチ天然変性タンパク質12,,1516乱れたループ テルミニからまで柔軟なシステムを記述することが可能です。粒子サイズ12の広い範囲と互換性がある考慮した、小角 x 線散乱は結晶構造の研究で対処することができます生物の質問の範囲を拡大すると相乗的に働くことができます。

続いて、機能ですが柔軟な C 末端は x 線結晶構造解析法に従う well-structured WD40 ドメインが含まれているために、Nsa1 はハイブリッド構造的アプローチに適しています。次に、クローニング、表現、およびハイブリッド x 線結晶構造解析により構造決定の出芽酵母Nsa1 ・小角 x 線散乱の浄化のためのプロトコル。このプロトコルは、秩序・無秩序領域の組み合わせで構成されていますが他の蛋白質の構造を勉強する合わせることができます。

Protocol

1. 組換えタンパク質生産・精製 Nsa 1 Nsa1 発現プラスミド設計とクローン作成 取得または出芽酵母ゲノム DNA を購入します。 PCR 増幅 Nsa1 のターゲット シーケンス (Nsa1フロリダ、残基 1-463) と C 末端切り捨て Nsa1 (Nsa1ΔC、残基 1-434)酵母および融点の由来ゲノム DNA を使用して適切なプライマーと1-2 分の延長時間を約 60 ° C。次のプライマーを用…

Representative Results

Nsa1 は、出芽酵母ゲノム DNA の増幅と subcloned MBP と TEV プロテアーゼ サイト続いて N ターミナル 6 x ヒスチジン親和性タグを含むベクトルに PCR をだった。Nsa1 は大腸菌BL21(DE3) 細胞に変換され、IPTG 誘導および 25 ° c 一晩 (図 1 a) 成長タンパク質発現の高収率が得られました。Nsa1 は、固定化コバルト親和性樹脂、TEV プロテアーゼと MBP…

Discussion

このプロトコルを使用すると、酵母から組換え Nsa1 は、x 線回折・小角 x 線散乱による構造研究に対して生成されました。Nsa1 は、ソリューションの行儀と複数の結晶形に結晶化されました。これらの結晶の最適化、中に Nsa1 の C 末端がプロテアーゼ分解に敏感であったことが発見されました。高解像度 Nsa1 の柔軟な C 末端が結晶の充填を妨げるために、斜方晶系の結晶形を Nsa1、可能?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

回折データは、東南地域共同アクセス (SER 猫) チーム 22 ID および 22 BM ビームラインの高度な光子ソース (AP)、アルゴンヌ国立研究所で収集されました。SIBYLS ビームライン事前光ソース (ALS)、ローレンス ・ バークレー国立研究所での小角 x 線散乱データを収集しました。リモート データの収集と処理の SIBYLS ビームラインでのスタッフに感謝したいと思います。タンパク質ドメインの境界を決定する助けのための環境健康科学の国立研究所 (NIEHS) 質量分析法による研究およびサポート グループに感謝しております。この作品によって、米国国立研究所の健康学内研究プログラムをサポートされていました米国立環境健康科学 (NIEHS) 研究所 (r. e. s. に ZIA ES103247) とカナダ保健研究 (機構、M.C.P に 146626) 機構。AP の使用は、米国エネルギー省、科学局、契約番号の下で基本的なエネルギー科学のオフィスによって支えられました。W-31-109-Eng-38。高度な照明のソース (ALS) の使用はディレクター、科学局、事務所のエネルギーの基礎科学、契約番号の下で米国エネルギー省によって支えられました。デ-AC02-05CH11231。追加サポート SIBYLS 小角 x 線散乱ビームラインは、国立衛生研究所からなるプロジェクト ミノス (R01GM105404) とハイエンド計装グラント S10OD018483。我々 もこの原稿の彼らの重要な読書のアンドレア ・月と博士サラ アンドレスに感謝したいと思います。

Materials

Molecular Cloning of Nsa1
pMBP2 parallel vector Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)
S. cerevisiae genomic DNA ATCC 204508D-5
Primers for cloning Nsa1
SC_Nsa1_FLFw IDT CGC CAA AGG CCT
ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT
GGATAG
SC_Nsa1_FLRv IDT AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT
GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC
AGC
SC_Nsa1_DeltaCFw IDT GGGCGCCATGGGATCCATGAGG
TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRv IDT GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC
CTTCCTTTTTTGCTTCCC
Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1
Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells Invitrogen C601003
pMBP- NSA1 and various truncations Lo et al., 2017
Selenomethionine Molecular Dimensions MD12-503B
IPTG, Dioxane-Free Promega V3953
EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001
Sodium Chloride Caledon Laboratory Chemicals 7560-1-80
Magnesium Chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
Tris Buffer, 1 M pH7.5 KD Medical RGF-3340
Glycerol Invitrogen 15514-029
beta-mercaptoethanol Sigma M6250
1M Imidazole, pH 8.0 Teknova I6980-06
Talon Affinity Resin Clonetech 635503
Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) Millipore UFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column GE-Healthcare 28989335
TEV Protease Prepared by NIEHS Protein Expression Core Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)
4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels BioRad 456-8056
Crystallization, Proteolytic Screening
Crystal Screen Hampton Research HR2-110
Crystal Screen 2 Hampton Research HR2-112
Salt Rx Hampton Research HR2-136
Index  Screen Hampton Research HR2-144
PEG/Ion Screen Hampton Research HR2-139
JCSG+ Molecular Dimensions MD1-37
Wizard Precipitant Synergy  Molecular Dimensions MD15-PS-T
Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates TTP Labtech 4150-05823
3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR4-506
Proti-Ace Kit Hampton Research HR2-429
PEG 1500 Molecular Dimensions MD2-100-6
PEG 400 Molecular Dimensions MD2-100-3
HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 Molecular Dimensions MD2-011-
Sodium Citrate tribasic Molecular Dimensions MD2-100-127
22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides Hampton Research HR3-231
24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) Hampton Research HR3-172
 18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) Hampton Research HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320
Magnetic Crystal Caps Hampton Research HR4-779
Magnetic Cryo Wand Hampton Research HR4-729
Cryogenic Foam Dewar Hampton Research HR4-673
Crystal Puck System MiTeGen M-CP-111-021
Full Skirt 96 well Clear Plate VWR 10011-228
AxyMat Sealing Mat VWR 10011-130
Equipment
UVEX-m JAN Scientific, Inc.
Nanodrop Lite Spectrophotometer Thermo-Fisher
Mosquito Robot TTP Labtech
Software/Websites
HKL2000 Otwinoski and Minor, 1997
Phenix Adams et al., 2010
Coot Emsley et al., 2010
ATSAS Petoukhov et al., 2012 https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
Scatter Rambo and Tainer, 2013
Pymol The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC.
BUNCH Petoukhov and Svergun, 2005
CRYSOL Svergun et al, 1995
PRIMUS Konarev et al, 2003
EOM Tria et al, 2015
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Referencias

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Lo, Y., Pillon, M. C., Stanley, R. E. Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae. J. Vis. Exp. (131), e56953, doi:10.3791/56953 (2018).
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