Flow Cytometry להעריך לוקמיה תאי גזע ראשי לוקמיה מיאלואידית חריפה, החולה-נגזר-xenografts, אבחון, מעקב.
Summary
אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול לזהות ביטוי בו זמנית של סמנים תאי לוקמיה בתאי לוקמיה מיאלואידית חריפה הראשי על-ידי cytometry זרימה. אנו מראים כיצד ניתן לכמת שלוש אוכלוסיות קדמון, אוכלוסיה ה-LSC בשם עם הגדלת מידת ההבשלה. אנחנו אישרו הנוכחות של אוכלוסיות אלה ב המתאים לחולה-נגזר-xenografts.
Abstract
לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) היא הטרוגנית, ואם אינו מטופל, מחלה קטלנית. . זה הגורם הנפוץ ביותר של סרטן הדם-הקשורים לתמותה אצל מבוגרים. בתחילה, AML היא מחלה של תאי גזע hematopoietic (HSC) המאופיינת מעצרו של בידול, עוקבות הצטברות תאים לוקמיה הפיצוץ, מופחתת ייצור של אלמנטים hematopoietic תפקודית. הטרוגניות משתרע על נוכחות של תאי גזע לוקמיה (ה-LSC), עם תא דינמי זה תא מתפתח כדי להתגבר על לחצים שונים לבחירה שהוטלו על במהלך התקדמות לוקמיה וטיפול. לשם הגדרה נוספת של האוכלוסייה ה-LSC, התוספת של CD90 ו- CD45RA מאפשר את האפליה של HSCs נורמלי, אבות multipotent בתוך תא תאי CD34 + CD38. כאן, אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול כדי לזהות ביטוי בו זמנית של מספר סמני ה-LSC בשם (CD34, CD38, CD45RA, CD90) בתאי הפיצוץ העיקרי של AML האנושית על ידי cytometry זרימה multiparametric. יתר על כן, אנו מראים כיצד ניתן לכמת שלוש אוכלוסיות קדמון, אוכלוסיה ה-LSC בשם עם הגדלת מידת ההבשלה. אנחנו אישרו הנוכחות של אוכלוסיות אלה ב המתאים לחולה-נגזר-xenografts. שיטה זו של זיהוי, כימות של ה-LSC בשם עשוי לשמש לצורך מעקב קליני של כימותרפיה תגובה (כלומר., מחלה שיורית מינימלית), כמו ה-LSC שיורית עלול לגרום AML relapse.
Introduction
לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) הוא הגורם הנפוץ ביותר של לוקמיה-הקשורים לתמותה. בתחילה, AML היא מחלה המשובטים של תאי גזע hematopoietic (HSC) המאופיינת מעצרו של בידול, עוקבות הצטברות תאים הפיצוץ, מופחתת ייצור של אלמנטים hematopoietic תפקודית. לאחרונה, הטרוגניות המשובטים של האוכלוסייה תא הפיצוץ הוקם בעיקרו באמצעות אסטרטגיות רצפי (הגדרות) ‘ הדור הבא ‘ ו מציג את קיומו של אינטרה-המשובטים התפתחות גידול תאים1.
הטרוגניות משתרע על הנוכחות של תאי גזע לוקמיה (ה-LSC). זה המשוערות זה את התא תא דינאמית מתפתחת כדי להתגבר על לחצים בחירה שונות שנכפו במהלך התקדמות לוקמיה וטיפול. לכן ה-LSC אמורים להיות עמידים בפני משטרי כימותרפיות הנוכחי ולסיים את התדרדרות המחלה, עם השלכות קליניות עמוקה2. סמנים שונים תוארו לאפיין את ה-LSC כמו CD1233, CLL-14, CD975 או טים-36. התא-CD34 + CD38 של תאים הפיצוץ נחשב להיות מועשר עבור ה-LSC7 , אך כולל גם HSC נורמלי. CD90 CD45RA הבעה המוחל על CD34 + CD38-תא (P6) (איור 1) מאפשרת הפרדת מספר שלבים של מבשרי hematopoietic נורמלי וממאירים8. באופן ספציפי, נורמלי CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-HSCs, multipotent אבות (MPP) כמו CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-תאי CD34 + CD38-CD90-CD45RA + הלימפה בשלה multipotent (LMPP) ובתאים יכול להיקבע ברוב המכריע של AML מקרים8 ,9. עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע (MFI) CD38 זה חשוב במיוחד להיחשב בתוך CD34 + תא התא. מכיוון CD38 עוצמת מגדיר שלושה חדשים תאים תאים הימנו: CD38 שלילי (P6), CD38 דים (P7), CD38 בהיר (P8) (איור 1). MFI של CD38 עשויים להיקבע באמצעות או hematogones ו/או תאים פלזמה כפקד של חיובי פנימי כפי שהתאים האלה מבטאים חריפה CD38.
Immunodeficient הנד/SCID/IL2Rγcnull (NSG) העכבר המודל משמש עבור engraftment של הנורמה, תאים ממאירים האדם hematopoietic10,11. השתלת איברים מבעלי חיים טורי מבחני משמשים לאימות השפעול פונקציית ה-LSC או מועדון הכדורגל מונפלייה. מחקרים אלה יש כבר ניתחו בהרחבה על ידי גישות רצף בקנה מידה גדול. עם זאת, פחות ידוע על immunophenotype ה-LSC ומועדון הכדורגל מונפלייה מאוכלוסיית הפיצוץ AML engrafted לתוך NSG עכברים לעומת AML העיקרי שלה (איור 2).
מספרי ה-LSC מטבעם נמוכים ולכן, וכימות של ה-LSC הם מאתגרים השיטה המתוארת כאן יכולה לשמש זרימת cytometric assay האבחון ועל מעקב קליני כדי להעריך את התגובה כימותרפיה (כמו ה-LSC שיורית עשוי לגרום AML relapse). הנוכחות של ה-LSC עשוי להצביע על מחלה שיורית מינימלית חיובי (MRD). עד כה, MRD ניטור ב- AML בעיקר להסתמך על שיטות מולקולרית (קרי, RT-PCR, המיתרים)10,12. עם זאת, ב פרוטוקול זה אנחנו לזהות ביטוי חלבון בו זמנית של מספר HSC/ה-LSC הסמנים (CD34, CD38, CD45RA, CD90) בתאי הפיצוץ העיקרי של AML האנושי על-ידי8,2,cytometry זרימה multiparametric9. שילוב זה של נוגדנים ניתן להחיל במעבדה cytometry זרימה רגילה כל ואת וזמינותו MRD זו הזרימה הוא מעניין במיוחד כאשר MRD על ידי תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת (RT-PCR) אינה אפשרית, כלומר, אם לוקמיה ספציפי מולקולרית סמני אינם לזיהוי במדגם AML אבחון. יתר על כן, פרוטוקול זה, הוא משלימים של טכניקות MRD מולקולרי יותר רגיש, מטרתו לזהות ולכמת את ובתאים hematopoietic חריג אשר מייצג מאפיין תפקודי התא (איור 3).
אנו מראים כיצד ניתן לכמת שלוש אוכלוסיות קדמון hematopoietic, בשם ה-LSC התא עם מידה שונה של התבגרות מאת cytometry זרימה עם נוגדנים זמינים ברוב המכריע של מעבדות קליניות. יתר על כן, אנו אישרו הנוכחות של אלה התא בתאים המתאימים למטופל-נגזר-xenografts (PDX), על טיפול מעקב.
Protocol
Representative Results
Discussion
הערכה מדויקת, לשחזור של הממברנה או סמני cytoplasmic מאת cytometry זרימה דורש כי כלי הגדרות אימות כל יום עבור יישור אופטי, ראוי תפקוד של מערכת fluidic, רגישות אופטי, סטנדרטיזציה באמצעות כיול חרוזים.
זיהוי של אוכלוסיות תאים הפיצוץ ב- AML באמצעות CD90 ו- CD45RA על-ידי ניתוח cytometry זרימה רב פרמטרית היא…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי הצרפתי האגודה לורט Fugain, סרטן le LigueContre (צפון מרכז), Fondation דה פראנס (ועדת לוקמיה), SIRIC Oncolille, מכון הסרטן הלאומי הצרפתי.
Materials
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) mice | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
Referencias
- Shlush, L. I., et al. Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells. Nature. , (2017).
- Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9 (9), e107587 (2014).
- Jordan, C. T., et al. The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells. Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).
- van Rhenen, A., et al. The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells. Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).
- Bonardi, F., et al. A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).
- Kikushige, Y., Miyamoto, T. Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia. Oncology. 89, 28-32 (2015).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).
- Kersten, B., et al. CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia. Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).
- Goardon, N., et al. Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).
- Ng, S. W., et al. A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia. Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia. J Clin Med. 6 (9), (2017).
- Swamydas, S., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Gabert, J., et al. Standardization and quality control studies of ‘real-time’ quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia – a Europe Against Cancer program. Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).
