Fluxo Cytometry para estimar leucemia células-tronco na leucemia mieloide aguda primária e no paciente-derivada-xenografts, diagnóstico e segue até
Summary
Nós esboçamos um protocolo para detectar a expressão simultânea de marcadores de células estaminais de leucemia em células de leucemia mieloide aguda primária por citometria de fluxo. Nós mostramos como quantificar três populações de progenitor e uma população de LSC putativa com crescente grau de maturação. Confirmamos a presença dessas populações no correspondentes paciente-derivada-xenografts.
Abstract
Leucemia mieloide aguda (LMA) é uma heterogênea e se não tratada, a doença fatal. É a causa mais comum de mortalidade associada a leucemia em adultos. Inicialmente, LMA é uma doença das células-tronco hematopoiéticas (HSC) caracteriza-se pela detenção de diferenciação, subsequente acúmulo de células de leucemia blast e reduziu a produção de elementos funcionais hematopoiéticas. Heterogeneidade que se estende para a presença de células-tronco leucemia (LSC), com esta dinâmica celular compartimento evoluindo para superar várias pressões de seleção imposta durante o tratamento e a progressão de leucemia. Para definir ainda mais a população do LSC, a adição de CD90 e CD45RA permite a discriminação dos linfócitos normais e progenitoras multipotentes dentro do compartimento de células CD34 + CD38. Aqui, nós esboçamos um protocolo para detectar a expressão simultânea de vários marcadores LSC putativos (CD34, CD38, CD45RA, CD90) em células de explosão primárias da LMA humana por citometria de fluxo Multiparamétrico. Além disso, mostramos como quantificar três populações de progenitor e uma população de LSC putativa com crescente grau de maturação. Confirmamos a presença dessas populações no correspondentes paciente-derivada-xenografts. Este método de deteção e quantificação da LSC putativa podem ser utilizados para o acompanhamento clínico da resposta de quimioterapia (i. e., doença residual mínima), como LSC residual pode causar recidiva da LMA.
Introduction
Leucemia mieloide aguda (LMA) é a causa mais comum de mortalidade associada a leucemia. Inicialmente, a AML é uma doença clonal de células-tronco hematopoiéticas (HSC) caracteriza-se pela detenção de diferenciação, subsequente acúmulo de blastos e reduziu a produção de elementos funcionais hematopoiéticas. Recentemente, clonal heterogeneidade da população celular explosão estabeleceu essencialmente usando estratégias de sequenciamento (NGS) na próxima geração e demonstrar a existência de evolução intra clonal de células de tumor1.
Heterogeneidade estende-se à presença de células leucêmicas (LSC). Supor que este compartimento celular dinâmico evolui para superar várias pressões de seleção impostas durante o tratamento e a progressão de leucemia. Portanto, LSC são suposto ser resistente aos regimes quimioterápicos atuais e mediar a recaída da doença, com profundas implicações clínicas2. Vários marcadores têm sido descritos para caracterizar LSC como CD1233, CLL-14, CD975 ou TIM-36. O CD34 + CD38-compartimento de blastos é considerado para ser enriquecido para LSC7 mas também inclui o HSC normal. CD90 e CD45RA expressão aplicada para o CD34 + CD38-compartimento (P6) (Figura 1) permite segregar os vários estágios de precursores hematopoiéticos normais e malignas8. Especificamente, normais CD34 + CD38-CD45RA + CD90-linfócitos, multipotentes progenitores (MPP) como as células CD34 + CD38-CD90dimCD45RA e CD34 + CD38-CD90-CD45RA + células progenitoras multipotentes linfoides-carregado (LMPP) podem ser determinadas na maioria dos AML casos8 ,9. A intensidade de fluorescência média (IFM) do CD38 é particularmente importante a ser considerado dentro do compartimento de células CD34 +. Porque CD38 intensidade define três compartimentos celulares novo respectivas: CD38 negativo (P6), CD38 ofuscante (P7) e brilhante CD38 (P8) (Figura 1). O IFM de CD38 podem ser determinadas usando hematogones e/ou células de plasma como um controle interno positivo, como estas células expressam fortemente CD38.
O modelo do ratonula (NSG) NOD/SCID/IL2Rγc imunodeficientes é amplamente utilizado para enxertia de normal e hematopoiético maligno humanos células10,11. Ensaios de Xenoenxerto serial são usados para validar experimentalmente LSC ou HSC função. Estes estudos foram analisados extensivamente por abordagens de sequenciamento em larga escala. No entanto, menos é sabido sobre a LSC e HSC imunofenótipo de população de explosão AML incorporada em camundongos NSG comparados com sua LMA primária (Figura 2).
Os números da LSC são inerentemente baixos assim, identificação e quantificação da LSC são desafiadores e o método descrito aqui pode ser usado como um ensaio de cytometric do fluxo, no diagnóstico e no acompanhamento clínico para avaliar a resposta de quimioterapia (como LSC residual pode causa recidiva da LMA). A presença de LSC pode indicar doença residual mínima positiva (MRD). Até à data, MRD monitoramento principalmente na LMA dependem de métodos moleculares (i.e., RT-PCR, NGS)10,12. No entanto, neste protocolo detectarmos expressão de proteínas simultâneo de vários marcadores HSC/LSC (CD34, CD38, CD45RA, CD90) em células de explosão primárias da LMA humana por citometria de fluxo Multiparamétrico2,8,9. Esta combinação de anticorpos pode ser aplicada em qualquer laboratório de citometria de fluxo padrão e este ensaio do MRD de fluxo é particularmente interessante quando MRD por reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) não é possível, ou seja, se moleculares específicos de leucemia marcadores não são detectáveis na amostra de LMA de diagnóstico. Além disso, este protocolo, é complementar as técnicas mais sensíveis de MRD moleculares, vez que visa detectar e quantificar as células progenitoras hematopoiéticas anormal que representa uma característica funcional da célula (Figura 3).
Nós mostramos como quantificar a três populações de progenitoras hematopoiéticas e o compartimento de LSC putativo com diferentes graus de maturação por citometria de fluxo com anticorpos disponíveis na maioria dos laboratórios clínicos. Além disso, nós confirmou a presença desses compartimentos celulares no correspondentes paciente-derivada-xenografts (PDX) e no tratamento de acompanhamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma avaliação precisa e reprodutível de membrana ou marcadores citoplasmáticos por citometria de fluxo requer que os ajustes do instrumento são verificados todos os dias para alinhamento óptico, adequado funcionamento do sistema fluídico, sensibilidade óptica e padronização usando contas de calibração.
Detecção de populações de células de explosão na LMA CD90 e CD45RA usando análise de citometria de fluxo multi paramétrico é um método relativamente simples e confiável. U…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado em parte pelo francês Associação Laurette Fugain, LigueContre le Cancer (Centro Norte), Fondation de France (Comité de leucemia), Oncolille SIRIC e francês National Cancer Institute.
Materials
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) mice | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
Referencias
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