Cultures de cellules primaires de l’épithélium pigmentaire rétinien de souris
Summary
L’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) est un épithélium multifonctionnel de le œil. Nous présentons ici un protocole visant à mettre en place des cultures de cellules primaires provenant de la RPE murine.
Abstract
L’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) est un épithélium multifonction hautement polarisé qui se trouve entre la rétine neurale et la choroïde de le œil. C’est une simple feuille de cellules pigmentées qui sont hexagonal emballés et reliés par des jonctions serrées. Les principales fonctions du RPP comprennent l’absorption de lumière, phagocytose des segments extérieurs cabanon photorécepteur, spatial tamponnage des ions, transport des nutriments, des ions et l’eau ainsi une participation active dans le cycle de visuel. Avec ces fonctions importantes et diverses, il est essentiel d’étudier la biologie des cellules RPE. Un certain nombre de lignées de cellules RPE ont été établi ; Cependant, les cellules immortalisées et repiquées sont connus rapidement perdre certaines caractéristiques morphologiques et physiologiques des cellules naturelles de RPE. Ainsi, les cellules primaires sont plus adaptés pour l’étude des différents aspects de la biologie cellulaire RPE et fonction. Culture de cellule pre primaire de souris est très utile pour les chercheurs car les modèles murins sont largement utilisés dans les études biologiques, cependant RPE de recueillir les cellules de souris est également très difficile en raison de leur petite taille. Nous présentons ici un protocole pour l’établissement de cultures de cellules de souris primaire RPE qui comprend l’énucléation et la dissection des yeux et l’isolement des feuilles RPE à produire les cellules de culture. Cette méthode permet une récupération efficace cellule. Les cellules RPE deux souris peuvent atteindre confluence sur un insert de membrane polyester 12 mm pré-chargés dans la plaque de culture après une semaine de la culture et Visualisez quelques-unes des propriétés originales de RPE véritable cellules telles que la forme hexagonale et la pigmentation après deux semaines de culture.
Introduction
L’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) est une seule couche de cellules épithéliales polarisées qui se trouve entre la rétine neurale et la choroïde de le œil. La fonctionnalité des cellules RPE et l’intégrité de la monocouche RPE sont critiques pour la vision car le RPE joue un rôle majeur dans plusieurs processus comme le maintien de la barrière de sang-rétinienne externe, de l’eau et des ions entre la rétine et la choroïde, légère absorption, protection contre le stress oxydatif, la régulation du métabolisme des rétinoïdes et phagocytose des segments externes des photorécepteurs1,2. L’emplacement de la RPE à l’arrière de le œil, ainsi que sa fonction de barrière empêchant les médicaments administrés systématiquement de passer du sang à l’humeur vitrée, il est difficile d’étudier la complexité de la RPE function in vivo. Ainsi, il y a un grand besoin de la mise en place de cultures de cellules RPE pour étudier les cellules RPE dans un environnement contrôlé flexible3,4.
Un certain nombre de lignées de cellules RPE établies existe, fournissant un moyen simple et commode d’obtenir et de stocker les cellules ; Cependant, les cellules repiquées ont quelques inconvénients par rapport aux cellules primaires2,3,4. Tout d’abord, ils sont souvent caractérisés par des changements dans la morphologie des cellules. Par exemple, aucun des lignées cellulaires existants ont été trouvés pour convenir à une étude fiable des propriétés barrière RPE en raison de la perte du phénotype de polarité cellulaire et la disparition partielle des jonctions serrées,4. Outre la perte de polarité et les connexions appropriées de cellule-cellule, les lignées de cellules RPE perdent rapidement leur pigmentation en raison de l’absence des enzymes clés mélanogénèse dans les adultes pre5. La pigmentation peut être restaurée, mais l’analyse approfondie du mécanisme de la re-pigmentation qui comprend une combinaison de microscopie électronique à transmission, gene expression analyse et chimique tests pour confirmer la présence de mélanine n’a jamais été effectué6. Une des limitations plus sont que les lignées de cellules RPE cellule longue vie (parfois – l’immortalité) et sous certaines conditions peuvent se transformer en l’autorenouvellement des cellules souches multipotentes qui en détacher le substrat et la forme flottante colonies7, 8. cette limitation, il est impossible d’utiliser les lignées cellulaires pour des expériences de transplantation3.
Considérant les inconvénients des lignées cellulaires établies RPE, les cultures primaires de cellules RPE obtenus à partir des tissus frais pourraient servir un modèle biologiquement plus pertinent d’étudier la RPE. Des cellules primaires de RPE ont été utilisés non seulement pour étudier les fonctions pre-spécifiques tels que le métabolisme de vitamine A9, phagocytose des photorécepteurs segments externes10 et ion transport11, mais aussi d’étudier la biologie de la cellule de base tels qu’épithéliales cellule polarité2 , homéostasie lysosomal et autophagie12,13.
Dans les deux dernières années, il y a eu un certain nombre de publications sur l’établissement des cultures primaires de RPE, ce qui indique un intérêt croissant dans ce domaine de recherche3,14,15. Nombreux protocoles pour les cellules humaines de RPE et cellules RPE non humains tels que les cellules RPE bovines et porcines ont été publiés16,17,18,19. Toutefois, il est plus difficile à gérer les cellules de souris RPE en raison de leur taille beaucoup plus petite. Même si un grand nombre de publications ont décrit des protocoles visant à isoler les cellules RPE de la souris14,20,21, il y a encore beaucoup de chercheurs qui luttent pour isoler les cellules RPE sans contamination des cellules choroïdes ou cellules des débris de la rétine neuronale. Nous présentons ici le protocole pour l’établissement principal de culture de cellules RPE, y compris l’obtention aux yeux de la souris, la dissection des yeux et l’isolement des feuilles RPE à produire les cellules de culture de la souris. Ce protocole vidéo serait particulièrement utile pour les chercheurs qui commencent à travailler avec les cultures primaires de RPE de souris et besoin de conseils sur les techniques de dissection.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole détaillé présenté permet création fiable de souris primaire RPE cultures qui atteignent la confluence après 1 semaine et présenter les principales caractéristiques RPE comme forme hexagonale et la pigmentation après 2 semaines. Les cellules RPE obtenus peuvent être utilisés pour un certain nombre d’applications en aval comme vitamine A metabolism9, phagocytose des photorécepteurs segments externes10 et ion transport11, cell…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée en partie par la Fondation BrightFocus (pour DS).
Materials
| animals | |||
| 2~3-week old wildtype mice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Dispase II | Sigma | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-Glutamine (200 mM) | GIBCO | 25030-081 | |
| Ethyl Alcohol | Fisher Scientific | 111000200 | |
| RPE65 antibody | A gift from Dr. Michael Redmond | ||
| Fluorescein Phalloidin | Invitrogen | F432 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| instruments and equipments | |||
| Laminar flow cabinet | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope) | Nikon | SMZ1500 | |
| CO2 incubator with hot air sterilization | Binder | C150 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp | STEPHENS instruments | S7-1320 | |
| Castroviejo suturing forceps 0.12mm | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Crescent straight knife | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1×0.06 mm Tips, Dumostar | World Precision Instruments | 500233 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, 45° Angle, Standard | World Precision Instruments | 500260 | |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGL0250S | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309632 | |
| Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED | Leica | ||
| Pipette | Gilson | ||
| Barrier and non-filtered pipette tips | Thermo Scientific |
Referencias
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