Primären Zellkulturen aus das retinale Pigmentepithel Maus
Summary
Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine multifunktionale Epithel des Auges. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur primären Zellkulturen, abgeleitet von der murinen RPE zu etablieren.
Abstract
Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine stark polarisierten multifunktionale Epithel, das liegt zwischen der neuronale Netzhaut und der Aderhaut des Auges. Es ist ein einzelnes Blatt der pigmentierten Zellen, die hexagonal verpackt und durch tight Junctions verbunden sind. Die Hauptfunktionen des RPE beinhalten Absorption von Licht, Phagozytose der Schuppen Photorezeptor äußeren Segmente, räumliche Pufferung von Ionen, Transport von Nährstoffen, Ionen und Wasser sowie aktive Beteiligung in der visuellen Zyklus. Mit solchen wichtigen und vielfältigen Funktionen ist es von entscheidender Bedeutung für die Biologie des RPE-Zellen zu studieren. Eine Reihe von RPE Zelllinien gegründet wurden; Allerdings sind Zellen passagiert und verewigt, einige der morphologischen und physiologischen Eigenschaften der natürlichen RPE-Zellen verlieren schnell bekannt. Primärzellen eignen sich daher eher für das Studium der verschiedenen Aspekte der RPE-Zellen-Biologie und Funktion. Maus RPE Zellen Primärkultur ist sehr nützlich, um Forscher da Mausmodellen in biologische Studien weit verbreitet sind, jedoch sammeln RPE Zellen von Maus auch aufgrund ihrer geringen Größe sehr anspruchsvoll. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die primäre Maustaste RPE Zellkulturen Einrichtung umfasst Enukleation und Dissektion der Augen und der Isolation der RPE Blätter um die Zellen für die Kultivierung zu erzielen. Diese Methode ermöglicht effiziente Zelle. Die RPE Zellen aus zwei Mäuse erreichen Konfluenz auf einer 12 mm Polyester Membran einfügen vorinstalliert in Kultur Platte nach einer Woche der Kultur und der Anzeige einige der ursprünglichen Eigenschaften von bona-fide RPE Zellen wie sechseckige Form und Pigmentierung nach zwei Wochen der Kultur.
Introduction
Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine einlagige polarisierten epithelialen Zellen, die sich zwischen der neuronale Netzhaut und der Aderhaut des Auges befindet. Die Funktionalität der RPE-Zellen und die Integrität des RPE Monolayer sind entscheidend für Vision, weil die RPE spielt eine wichtige Rolle in mehreren Prozessen wie Erhaltung der äußeren Blut-Retina-Schranke, Transport von Wasser und Ionen zwischen der Netzhaut und die Aderhaut, Licht-Absorption, Schutz vor oxidativem Stress, Kontrolle der Retinoid Stoffwechsel und Phagozytose der äußeren Segmente der Photorezeptoren1,2. Die Lage des RPE auf der Rückseite des Auges, sowie seine Barrierefunktion aus vorbei aus dem Blut zu den Glaskörper systemisch verabreichten Medikamente zu verhindern erschweren es, die Komplexität des RPE Funktion in Vivozu untersuchen. So gibt es ein großes Bedürfnis für die Einrichtung von RPE Zellkulturen, die RPE-Zellen in einem flexiblen, kontrollierten Umgebung3,4zu studieren.
Es gibt eine Reihe von etablierten Zelllinien RPE, bietet eine einfache und bequeme Möglichkeit der Gewinnung und Lagerung der Zellen; passagiert Zellen haben jedoch einige Nachteile im Vergleich zu Primärzellen2,3,4. Erstens sind sie oft durch Veränderungen der Zellmorphologie gekennzeichnet. Keiner der existierenden Zelllinien fanden sich beispielsweise für eine zuverlässige Studie über die RPE-Barriere-Eigenschaften durch den Verlust der Zelle Polarität Phänotyp und teilweise verschwinden der tight Junctions4geeignet. Neben dem Verlust der Polarität und korrekte Zell-Zell-Verbindungen verlieren die RPE-Zell-Linien schnell ihre Pigmentierung aufgrund des Fehlens der wichtigsten Melanogenese Enzyme in den Erwachsenen RPE-5. Die Pigmentierung kann wiederhergestellt werden, aber die umfassende Analyse des Mechanismus der Re-Pigmentierung, also auch für eine Kombination von Transmissions-Elektronenmikroskopie, gen Ausdruck Analyse und chemische Tests bestätigen das Vorhandensein von Melanin hat nie Sie waren bereits im durchgeführten6. Eine weitere Einschränkung ist, dass die RPE-Zelllinien verlängerte Zelllebensdauer (manchmal – Unsterblichkeit) und unter bestimmten Bedingungen können selbst erneuernde multipotente Stammzellen, die aus dem Substrat und schwimmende Kolonien7, Form lösen verwandeln 8. diese Einschränkung macht es unmöglich, die Zelllinien für Transplantation3Experimente zu verwenden.
In Anbetracht der Nachteile der etablierten Zelllinien RPE vielleicht RPE Zellen Primärkulturen aus frischem Gewebe gewonnen mehr biologisch relevante RPE studieren Modellcharakter. Primäre RPE-Zellen werden nicht nur RPE-spezifische Funktionen zu studieren, wie z. B. Vitamin A-Stoffwechsel-9, Phagozytose der Photorezeptor Außensegmenten10 und Ionen-transport11, sondern auch grundlegende Zelle Biologie zu studieren, wie epithelialen Zelle Polarität2 , lysosomale Homöostase und Autophagie12,13.
In den letzten Jahren gab es eine Reihe von Publikationen über die Einrichtung von Primärkulturen RPE, zeigt ein wachsendes Interesse an diesem Bereich der Forschung3,14,15. Zahlreiche Protokolle für RPE-Zellen menschlichen und nichtmenschlichen RPE-Zellen wie Rinder und Schweine RPE-Zellen wurden veröffentlicht16,17,18,19. Es ist jedoch schwieriger zu handhaben Maus RPE-Zellen aufgrund ihrer viel kleineren Größe. Obwohl eine ganze Reihe von Publikationen Protokolle zu isolieren, RPE-Zellen von der Maus14,20,21beschrieben haben, gibt es noch viele Forscher, die kämpfen, um zu isolieren, RPE-Zellen ohne Kontamination der Aderhaut Zellen oder Zellen aus neuronale Netzhaut Schutt. Hier stellen wir das Protokoll für die Gründung der primäre Maustaste RPE Zellkultur, einschließlich des Erhalts der Augen von der Maus, Dissektion der Augen und der Isolation der RPE Blätter um die Zellen für die Kultivierung zu erzielen. Dieses video Protokoll wäre besonders nützlich für Forscher, die anfangen zu arbeiten mit Maus Primärkulturen RPE und brauchen Führung über die Präparation Techniken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die vorgestellte ausführliche Protokoll ermöglicht zuverlässige Einrichtung des Maus RPE Primärkulturen, die Konfluenz nach 1 Woche zu erreichen und die Hauptmerkmale der RPE wie sechseckige Form und Pigmentierung nach 2 Wochen. Die gewonnenen RPE-Zellen für eine Anzahl von downstream-Anwendungen wie z. B. Vitamin A Stoffwechsel9, Phagozytose der Photorezeptor Außensegmenten10 und Ionen-Transport11, Epithelzelle Polarität2</s…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde teilweise durch die BrightFocus Foundation (für DS) finanziert.
Materials
| animals | |||
| 2~3-week old wildtype mice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Dispase II | Sigma | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-Glutamine (200 mM) | GIBCO | 25030-081 | |
| Ethyl Alcohol | Fisher Scientific | 111000200 | |
| RPE65 antibody | A gift from Dr. Michael Redmond | ||
| Fluorescein Phalloidin | Invitrogen | F432 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| instruments and equipments | |||
| Laminar flow cabinet | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope) | Nikon | SMZ1500 | |
| CO2 incubator with hot air sterilization | Binder | C150 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp | STEPHENS instruments | S7-1320 | |
| Castroviejo suturing forceps 0.12mm | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Crescent straight knife | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1×0.06 mm Tips, Dumostar | World Precision Instruments | 500233 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, 45° Angle, Standard | World Precision Instruments | 500260 | |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGL0250S | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309632 | |
| Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED | Leica | ||
| Pipette | Gilson | ||
| Barrier and non-filtered pipette tips | Thermo Scientific |
Referencias
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