Therapie, die Tests in einem Sphäroid-basierten 3D Kultur Zellmodell für Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür
Summary
Wir beschreiben die Evolution ein Sphäroid-basierte, dreidimensionales in Vitro -Modell, das uns ermöglicht, den aktuellen Stand der experimentellen Therapie-Schemata für Kopf und Nacken Squamous Zelle Krebsgeschwür auf Zelllinien, testen, zur Bewertung der Therapie Empfänglichkeit und Resistenz auf primäre Zellen aus menschlichen Proben in der Zukunft.
Abstract
Aktuelle Behandlungsmöglichkeiten für Fortgeschrittene und wiederkehrende Kopf- und Nacken Squamous Zelle Krebsgeschwür (lokal) umschließen Strahlen- und Chemo-Bestrahlung Ansätze mit oder ohne Operation. Während Platin-basierten Chemotherapie-Regimen derzeit stellen den Gold Standard in Bezug auf die Wirksamkeit und sind in der überwiegenden Mehrzahl der Fälle, neue Chemotherapie-Regimen gegeben nämlich Immuntherapie entstehen. Die Response-Raten und Therapie Resistenzmechanismen für entweder Chemo-Therapie sind jedoch schwer zu prognostizieren und bleiben nur unzureichend verstanden. Breitere Variationen von Chemo- und Strahlentherapie Resistenzmechanismen sind bisher bekannt. Diese Studie beschreibt die Entwicklung eines standardisierten, Hochdurchsatz- in-vitro- Assays als zukünftige Werkzeug für personalisierte Tumor lokal Zelllinie Reaktion auf verschiedene Therapie-Schemata, und hoffentlich auf Primärzellen von einzelnen Patienten einzuschätzen Therapie. Der Test wurde entwickelt, um die qualitätsgesicherte Standardalgorithmus für lokal Patienten in unserem Center tertiäre Versorgung integriert wird; Dies wird jedoch Gegenstand zukünftiger Studien sein. Technischer Machbarkeit sieht vielversprechend aus für primäre Zellen vom Tumor Biopsien von tatsächlichen Patienten. Proben werden dann in das Labor übertragen. Biopsien werden mechanisch getrennt, gefolgt von enzymatischen Verdauung. Zellen werden dann in extrem niedrige Adhäsion Zelle Kultur Fläschchen kultiviert, die reproduzierbare, standardisierte und spontane Bildung von dreidimensionalen, Sphäroid-förmige Zelle Konglomerate zu fördern. Sphäroide sind dann bereit, Chemo-Bestrahlung Protokolle und Immuntherapie Protokolle nach Bedarf ausgesetzt werden. Die endgültige Zellengröße Lebensfähigkeit und Sphäroid sind Indikatoren für Therapie-Anfälligkeit und konnte daher in Betracht in Zukunft zu beurteilen, die Patienten wahrscheinlich therapieantwort gezogen werden. Dieses Modell könnte eine wertvolle, kostengünstige Instrument für personalisierte Therapie bei Kopf-Hals-Tumoren.
Introduction
Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür (lokal) ist die sechsthäufigste Krebsart weltweit mit einer steigenden Inzidenz von Schleimhaut human Papilloma Virus (HPV) Infektion-assoziierten Pathogenese, neben den meisten Fällen verursacht durch übermäßigen Nikotin- und Alkoholkonsum Verbrauch 1,2. Während kleinere Tumoren und vor invasiven Stadien in der Regel gut behandelbar mit chirurgische Exzision sind, in der Regel kombiniert mit zervikalen Lymphknoten Dissektion, bleibt die Behandlung für fortgeschrittenen und wiederkehrende lokal schwierig wegen aggressiven Tumorinvasion mit Metastasierung und Resistenz gegen Strahlung und Chemotherapie-Protokolle3,4,5,6,7,8. Neuere Studien legen nahe, eine hohe Variabilität des zellulären Phänotyps und Sub-Charakterisierung von zirkulierenden und disseminierter Tumorzellen hat gerade erst begonnen,9,10. Der frühere glaube eines festen, einheitlichen Tumors Masse musste in der Vergangenheit im Lichte der jüngsten Studien revidiert werden Jahre11,12,13,14. Aktuelle Ansätze zur Tumor-Charakterisierung und Identifizierung der wichtigsten Mutationen konnten mehrere Gene identifizieren, die scheinen zu Therapieresistenz zugeordnet werden, sondern bleiben eine kostenintensive Ansatz. Kenntnisse des Genotyps ermöglicht darüber hinaus nicht notwendigerweise eine zuverlässige Vorhersage der Phänotyp und den Behandlungserfolg.
Es wurden einige Fortschritte bei der Verbesserung der allgemeinen und krankheitsfreien Überleben für die fortgeschrittenen und wiederkehrende Krankheit. Für Nikotin – sowie Virus-assoziierten Karzinomen beilegen aktuelle Behandlungsoptionen neben Chirurgie aggressive Strahlung und Platin-basierten Chemotherapie-Regimen. Es wurden Auswirkungen auf die verschiedenen Response-Raten zwischen HPV-negativen und positiven Karzinom; aber dies ist noch nicht führen zu einer Veränderung im allgemeinen Therapierichtlinien. Resistenz gegen Strahlung und Chemotherapie ist ein weit verbreitetes Phänomen in allen Tumorstadien und existiert für Platin-basierten Chemotherapie sowie zielgerichtete Therapie (Anti-EGFR; epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor) und vor kurzem neue Checkpoint Hemmung15. Unwirksame Strahlen- und Chemotherapie kommen zu einem hohen Preis von erheblichen geduldigen Morbidität bei Dysphagie, Mukositis, Mundtrockenheit und Risiko der Abnahme der Nieren- oder kardiale Funktion unter anderem. Vorhersage der Reaktion vor der Therapie scheint die Entscheidung des allgemeinen Therapiekonzept für jeden einzelnen Patienten das entscheidende Ziel, verhindern unnötige Behandlungskonzepte, Nebenwirkungen und Kosten.
Wir versuchten, ein Modell des einzelnen Patienten Behandlung Anfälligkeit gegenüber aktuellen standard Chemo-Bestrahlung zu testen, der in der regulären und qualitätskontrollierten onkologischen Behandlung Algorithmus von einem technischen Stand Punkt integriert werden konnte. Ferne Ziel war es, das Modell ohne verwenden stark verändert und im Alter von Zelllinien, wie schlecht sie tatsächlichen menschlichen Tumorzellen ohne ihre Variabilität vertreten und Heterogenität wie wir jetzt, während der Einrichtung des Protokolls Wissen in verschiedenen Zelllinien erfolgte. Um nur von im Handel erhältlichen Zelllinien unabhängig zu sein, erzielten wir kürzlich erfolgreich eine mittlere Zell-Linie namens “PiCa” aus primären lokal Zellen aus menschlichen Tumor Proben mit konservierten zellulären Marker auf seine Oberflächen und begrenzte Passagen 16. this PiCa-Zell-Linie soll dazu dienen als Vorbereitung für die Entwicklung des Modells auf die Straße, dann später nach Prozessen mit frischem menschlichen Krebszellen vom Tumor Biopsien. Es hat sich gezeigt, dass Zellen in dreidimensionale Zelle Kulturen unterschiedlich reagieren und mehr in-Vivo-gerne Verwaltung von Krebs-Medikamente als die wachsende Monolagen17,18,19,20 ,21, vor allem auf Erhaltung der wandernden und Sub Differenzierung Eigenschaften von bestimmten Zelle Teilmengen22,23,24. Hier beschreiben wir das Protokoll ein Sphäroid-basierte, dreidimensionales Modell von intermediate Zelllinien und primären menschlichen Plattenepithelkarzinom Zellen und Möglichkeiten wie ein solches Modell in Krebsbehandlung von Kopf-Hals-Chirurgen und Onkologen ( integrieren Abbildung 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir waren in der Lage, ein Protokoll, um reproduzierbare Sphäroide aus Zellsuspensionen, für beide Zelllinien und in Vorversuchen, primären menschlichen Tumorzellen zu generieren. Wir zunächst zwei zuvor beschriebene Methoden bewertet und identifiziert die ULA-Methode, eine Methode wo Kultur Platten mit ultraniedriger Klebeflächen verwendet werden, um für die Generation der einheitlichen dreidimensionalen Sphäroide die sicherer und zuverlässiger ist. Durch die Kombination von zwei separate Methoden für Assay aus…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde gefördert durch ein Stipendium von der Universität München (FöFoLe Projekt-Nr.: 789-781).
Materials
| Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) | Biochrom, Berlin, Germany | F 0425 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Paisley, UK | 10500-064 | |
| penicillin/streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2212 | |
| sodium pyruvate | Biochrom, Berlin, Germany | L0473 | |
| non-essential amino acids | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| L-Glutamine | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| Liberase | Roche Life Sciences, Basel, Switzerland | 5401127001 | |
| GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS 06-001 | |
| GravityTRAP plate | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS-01-001 | |
| Ultra-low attachment (ULA) culture plates | Corning, Corning, NY, USA | 4520 | |
| airway epithelial cell growth medium | Promocell, Heidelberg, Germany | C-21060 | |
| amphotericin B | Biochrom, Berlin, Germany | A 2612 | |
| airway epithelial cell growth medium supplement mix | Promocell, Heidelberg, Germany | C39165 | |
| WST-8 test | Promocell, Heidelberg, Germany | PC PK-CA705-CK04 | |
| Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL | Invitrogen | #17005-034 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg | Invitrogen | #37000015 | |
| Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg | Invitrogen | #37000015 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | #21068-028 | |
| Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| F12 Nutrient Mix | Invitrogen | #21765-029 | |
| Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) | Invitrogen | #35050087 | |
| HBSS (Ca, Mg) | Life Technologies | #14025-092 | (no phenol red) |
| 1x TrypLE Expres Enzyme | Invitrogen | #12604-013 | (no phenol red) |
| Accutase (enzymatic cell detachment solution) | Innovative cell technologies | Cat# AT104 | |
| 70 µm Falcon cell strainer | BD Biosciences, USA | #352350 |
Referencias
- Hunter, K. D., Parkinson, E. K., Harrison, P. R. Profiling early head and neck cancer. Nat Rev Cancer. 5 (2), 127-135 (2005).
- Jerjes, W., et al. The effect of tobacco and alcohol and their reduction/cessation on mortality in oral cancer patients: short communication. Head Neck Oncol. 4, 6 (2012).
- Chen, H. H. W., Kuo, M. T. Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges. Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).
- Boeckx, C., et al. Anti-epidermal growth factor receptor therapy in head and neck squamous cell carcinoma: focus on potential molecular mechanisms of drug resistance. Oncologist. 18 (7), 850-864 (2013).
- Brand, T. M., Iida, M., Wheeler, D. L. Molecular mechanisms of resistance to the EGFR monoclonal antibody cetuximab. Cancer Biol Ther. 11 (9), 777-792 (2011).
- Seidl, D., Schild, S. E., Wollenberg, B., Hakim, S. G., Rades, D. Prognostic Factors in Patients Irradiated for Recurrent Head-and-Neck Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6547-6550 (2016).
- Shirai, K., et al. Clinical Outcomes of Definitive and Postoperative Radiotherapy for Stage I-IVB Hypopharyngeal Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6571-6578 (2016).
- Theile, D., et al. Evaluation of drug transporters’ significance for multidrug resistance in head and neck squamous cell carcinoma. Head Neck. 33 (7), 959-968 (2011).
- Slade, M. J., et al. Comparison of bone marrow, disseminated tumour cells and blood-circulating tumour cells in breast cancer patients after primary treatment. Brit J Cancer. 100 (1), 160-166 (2009).
- Mockelmann, N., Laban, S., Pantel, K., Knecht, R. Circulating tumor cells in head and neck cancer: clinical impact in diagnosis and follow-up. Eur Arch Otorhinolaryngol. 271 (1), 15-21 (2014).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
- Ledgerwood, L. G., et al. The degree of intratumor mutational heterogeneity varies by primary tumor sub-site. Oncotarget. 7 (19), 27185-27198 (2016).
- Loyo, M., et al. Lessons learned from next-generation sequencing in head and neck cancer. Head Neck. 35 (3), 454-463 (2013).
- Morris, L. G., et al. The Molecular Landscape of Recurrent and Metastatic Head and Neck Cancers: Insights From a Precision Oncology Sequencing Platform. JAMA Oncol. , (2016).
- Bauml, J. M., Cohen, R. B., Aggarwal, C. Immunotherapy for head and neck cancer: latest developments and clinical potential. Ther Adv Med Oncol. 8 (3), 168-175 (2016).
- Mack, B., et al. Rapid and non-enzymatic in vitro retrieval of tumour cells from surgical specimens. PLoS One. 8 (1), e55540 (2013).
- Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 939-954 (2016).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. J Biomol Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Cancer Genome Atlas, N. Comprehensive genomic characterization of head and neck squamous cell carcinomas. Nature. 517 (7536), 576-582 (2015).
- Duarte, S., et al. Isolation of head and neck squamous carcinoma cancer stem-like cells in a syngeneic mouse model and analysis of hypoxia effect. Oncol Rep. 28 (3), 1057-1062 (2012).
- Reid, P. A., Wilson, P., Li, Y., Marcu, L. G., Bezak, E. Current understanding of cancer stem cells: Review of their radiobiology and role in head and neck cancers. Head Neck. 39 (9), 1920-1932 (2017).
- Cossu, F., et al. Structural Insight into Inhibitor of Apoptosis Proteins Recognition by a Potent Divalent Smac-Mimetic. PLoS ONE. 7 (11), e49527 (2012).
- Hagemann, J., et al. Spheroid-based 3D Cell Cultures Enable Personalized Therapy Testing and Drug Discovery in Head and Neck Cancer. Anticancer Res. 37 (5), 2201-2210 (2017).
- Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies?. PLoS Med. 7 (3), e1000245 (2010).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).
- Chitcholtan, K., Asselin, E., Parent, S., Sykes, P. H., Evans, J. J. Differences in growth properties of endometrial cancer in three dimensional (3D) culture and 2D cell monolayer. Exp Cell Res. 319 (1), 75-87 (2013).
- Longati, P., et al. 3D pancreatic carcinoma spheroids induce a matrix-rich, chemoresistant phenotype offering a better model for drug testing. BMC Cancer. 13, 95 (2013).
