머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 회전 타원 체 기반 3D 셀 문화 모델에서 테스트 하는 치료

Summary

우리는 치료 평가 우리 셀 라인에 머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 실험적인 치료 regimens의 현재 표준 테스트를 가능 하 게 한 회전 타원 체를 기반으로, 3 차원 생체 외에서 모델의 진화 설명 민감성 및 미래에 인간의 표본에서 1 차 셀에 저항.

Abstract

고급 및 재발 머리와 목 편평 상피 세포 암 (HNSCC)에 대 한 현재의 치료 옵션은 방사선 및 항 암 치료 방사선 접근 또는 수술 없이 묶습니다. 백 금 기반의 화학요법 식이요법 현재 효능 측면에서 금 표준을 동안에 대부분의 경우, 새로운 화학요법 식이요법, 즉 immunotherapy 등장 하고있다. 그러나, 응답 속도 및 치료 저항 메커니즘 중 항 암 치료 처방에 대 한 예측 하 고 제대로 이해 남아 있습니다. 항 암 치료 및 방사선 저항 메커니즘의 광범위 한 변화는 날짜를 알려져 있습니다. 이 연구는 표준화, 높은 처리량에 생체 외에서 분석 결과의 개인된 종양에 대 한 미래의 도구로 개별 환자에서 HNSCC 셀 라인의 응답 다양 한 치료 식이요법, 그리고 잘하면 1 차 셀을 평가 하기 위해 개발을 설명 합니다. 치료입니다. 분석 결과 우리의 제 3 배려 센터; HNSCC 환자에 대 한 품질 제어 표준 알고리즘에 통합 되 고 하도록 설계 되었습니다. 그러나,이 미래 연구의 대상이 될 것입니다. 기술적 타당성 실제 환자에서 종양 생 검에서 1 차 셀에 대 한 약속 같은 데. 표본은 다음 실험실으로 전송 됩니다. Biopsies는 기계적으로 따라 효소 소화에 의해 구분 됩니다. 다음 셀에 3 차원, 회전 타원 체 모양의 셀 대기업의 재현, 표준 및 자발적 형성을 촉진 하는 매우 낮은 접착 셀 문화 튜브 교양. Spheroids 다음 프로토콜과 immunotherapy 프로토콜 필요에 따라 항 암 치료 방사선에 노출 될 준비가 됩니다. 마지막 셀 생존 및 회전 타원 체 크기 치료 민감성의 지표 이며 환자 들 치료 가능성이 응답을 평가 하기 위해 미래에 고려 사항으로 얻을 수 수 있습니다. 이 모델 쪽으로 머리와 목 암 맞춤된 치료 가치, 비용 효율적인 도구 수 있습니다.

Introduction

머리와 목 편평 상피 세포 암 (HNSCC)는 여섯 번째 가장 일반적인 암 전세계 점 막 인간 유 두 종 바이러스 (HPV) 감염 관련 pathogenesis, 대부분의 경우 과도 한 니코틴과 알콜으로 인 한 옆의 상승 부각 소비 ^1,2. 고급 단계와 재발 HNSCC에 대 한 치료 남아 공격적인 종양 침공으로 인해 도전 작은 종양 전 침략 적인 단계는 일반적으로 외과 절단, 일반적으로 자 궁 경부 림프절 절 개와 결합으로 잘 치료할 수 전이성 확산 및 저항 방사선 및 화학 요법 프로토콜^3,,45,6,7,8. 최근 연구 제안 세포 표현 형의 높은 가변성 및 순환의 하위 특성화 고 전파 종양 세포 막^9,10를 시작 했다. 고체, 균일 한 종양의 이전 신념 질량 과거에 최근의 연구에 비추어 수정 되어야 했다 년^11,12,13,14. 종양 특성 및 주요 돌연변이의 id에 대 한 현재 접근 여러 유전자 치료 저항에 연결할 수 있지만 비용 집약적인 접근을 유지 하는 것을 식별할 수 있는. 또한, 유전자 형의 지식 표현 형 및 치료 응답의 신뢰할 수 있는 예측을 반드시 허용 하지 않습니다.

고급 단계와 재발 성 질환에 대 한 전체 및 질병-무료 생존 개선 몇 발전 되었습니다. 니코틴-로 바이러스 관련 암, 수술 외에 현재 치료 옵션이 공격적 방사선 및 백 금 기반의 화학요법 식이요법을 묶습니다. 자 궁 부정과 긍정적인 암; 사이 다른 응답 속도 대 한 의미 되었습니다. 그러나,이 되지 않은 아직 변화를 일반적 치료 지침 이어질. 저항 방사선 및 화학 요법 광범위 한 현상에서 모든 종양 단계 이며 백 금 기반 화학 요법 또한 타겟된 치료 (안티-EGFR;에 관해서는 존재 표 피 성장 인자 수용 체) 그리고 최근 검사점 금지¹⁵신흥. 효과 없는 방사선 및 화학 요법 dysphagia, mucositis, 구강 건조와 다른 사람 사이 신장 또는 심장 기능의 감소의 위험이 큰 환자 사망률의 높은 비용에 온다. 치료 응답 사전 예측 각 개별 환자에 대 한 일반적인 치료 개념의 결정 중요 한 목표는, 불필요 한 치료 개념, 부작용 및 비용 방지 될 것으로 보인다.

우리가 현재 표준 항 암 치료-방사선 기술 서 점에서 일반 및 품질 제어 종양 치료 알고리즘에 통합 될 수을 향해 개별 환자의 치료 민감성을 테스트 하는 모델을 확립 하고자 했다. 멀리 목표 그들은 제대로 그들의 변화 없이 실제 인간 종양 세포를 대표 하 고이 프로토콜의 설립 동안 지금, 아시다시피 이루어졌다 다양 한 셀 라인에 무 겁 게 변경 하 고 세 셀 라인을 사용 하지 않고 모델을 사용 했다. 상업적으로 사용 가능한 셀 라인 에서만 독립 수, 우리 최근 성공적으로 생성 “피 카” 라는 중간 셀 라인 인간의 종양 표본에서 기본 HNSCC 세포에서 그것의 표면 및 한정 된 구절 ^{에 보존 세포 마커 16}.이 피 카 셀 라인 나중 다음 신선한 인간의 암 세포 실험에서 종양 생 검에도 모델의 개발에 대 한 준비로 봉사 해야 한다. 그것은 그 문화는 다르게 반응 하는 3 차원 셀 및 더 많은 vivo에서세포 표시 되었습니다-monolayers^{17,,1819,20에서에서 성장 보다 암 약물의 관리 같은 ,21}, 철새의 보존 때문에 주로 및 특정 셀 하위 집합^22,,2324의 하위 차별화 속성. 여기, 우리가 중간 셀 라인에서 회전 타원 체를 기반으로, 3 차원 모델의 프로토콜을 설명 하 고 기본 인간의 편평 세포 암 종 세포와 방법을 어떻게 통합 같은 모델 머리와 목 외과 및 종양학 ( 의 암 치료 그림 1).

Protocol

이 원고, 즉 인간의 종양 견본의 사용에 표시 된 모든 연구는 사전 결정에서 대학 의학의 마인츠/대학 뮌헨 의료 센터 윤리 위원회의 동의 보호 됩니다. 환자는 그들의 치료 과정에서 얻은 초과 생물학 자료의 과학적인 사용에 동의 하는 국가 법률 지침에 따라 동의 주었다. 연구는 인간의 복지에 대 한 모든 기관, 국가 및 국제 지침에 따라 수행 되었습니다. 1. 머리와 도대체 편?…

Representative Results

우리 reproducibly 나중 Hagemann 외 에 설명 된 대로 신선한 종양 생 검에서 파생 하는 기본 인간 암 세포에서에서 독점 피 카 셀 라인을 포함 하 여 다른 셀 라인에서 먼저 단일 셀 정지에서 spheroids 생성 수 있었다 . 26. 우리는 회전 타원 체 세대;에 대 한 두 가지 설립된 방법 평가 소위 교수형 되 고 두 드롭 (HD) 메서드와 매우 낮은 접착 (울 라) 메서드, ?…

Discussion

우리는 세포 정지, 예비 실험, 기본 인간 종양 세포에서에서 그리고 두 셀 라인에서 재현 spheroids를 생성 하는 프로토콜을 설정할 수 있었다. 우리는 먼저 앞에서 설명한 두 가지 방법으로 평가 하 고 울 라-방법, 어디 낮은 접착 표면 배양 배지는 사용 되는 방법, 일정 한 3 차원 spheroids의 생성에 대 한 안전 하 고 더 안정적인 것을 확인. 분석 결과 읽기 (크기/위치 및 세포 생존)에 대 한 두 개의 별도…

Materials

Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM)	Biochrom, Berlin, Germany	F 0425
Fetal bovine serum	Gibco Life Technologies, Paisley, UK	10500-064
penicillin/streptomycin	Biochrom, Berlin, Germany	A2212
sodium pyruvate	Biochrom, Berlin, Germany	L0473
non-essential amino acids	Biochrom, Berlin, Germany	K0293
L-Glutamine	Biochrom, Berlin, Germany	K0293
Liberase	Roche Life Sciences, Basel, Switzerland	5401127001
GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform	InSphero, Schlieren, Switzerland	PB-CS 06-001
GravityTRAP plate	InSphero, Schlieren, Switzerland	PB-CS-01-001
Ultra-low attachment (ULA) culture plates	Corning, Corning, NY, USA	4520
airway epithelial cell growth medium	Promocell, Heidelberg, Germany	C-21060
amphotericin B	Biochrom, Berlin, Germany	A 2612
airway epithelial cell growth medium supplement mix	Promocell, Heidelberg, Germany	C39165
WST-8 test	Promocell, Heidelberg, Germany	PC PK-CA705-CK04
Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL	Invitrogen	#17005-034
Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg	Invitrogen	#37000015
Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg	Invitrogen	#37000015
DMEM High Glucose	Invitrogen	#21068-028
Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin	Invitrogen	#15140-122
F12 Nutrient Mix	Invitrogen	#21765-029
Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl)	Invitrogen	#35050087
HBSS (Ca, Mg)	Life Technologies	#14025-092	(no phenol red)
1x TrypLE Expres Enzyme	Invitrogen	#12604-013	(no phenol red)
Accutase (enzymatic cell detachment solution)	Innovative cell technologies	Cat# AT104
70 µm Falcon cell strainer	BD Biosciences, USA	#352350