الروغان السطحية من جسيمات نانوية فيروس التهاب الكبد الوبائي ه استخدام أساليب تصريف المواد الكيميائية
Summary
ونحن قد هندسة البروتين قفيصه من فيروس التهاب الكبد الوبائي ه نانوحبيبات ثيرانوستيك (هيفنب). هيفنب تجميع ذاتي في قفص icosahedral مستقرة في إيصال المخاطية. وهنا يصف لنا بتعديل هيفنبس للورم الاستهداف بتحور يتعرض سطح المخلفات إلى سيستينيس، الذي متزاوجة يغاندس الاصطناعية التي تربط الخلايا السرطانية على وجه التحديد.
Abstract
جسيمات شبيهة بالفيروس (فلبس) استخدمت نانوكاريرس لعرض الأجنبية [ابيتوبس] و/أو تسليم الجزيئات الصغيرة في الكشف والعلاج من الأمراض المختلفة. يعتمد هذا التطبيق على التحوير الوراثي، التجميع الذاتي وتصريف سيستين للوفاء بتطبيق استهداف الورم من المؤتلف فلبس. بالمقارنة مع الوراثية يقدم التعديل الاقتران وحدها، والمواد الكيميائية من الببتيدات الأجانب إلى فلبس كبير فائدة لأنه يسمح بمجموعة متنوعة من الكيانات، مثل الببتيدات الاصطناعية أو oligosaccharides، يكون مترافق لسطح فلبس بطريقة مرنة والتضمين دون تغيير للجمعية عزام.
هنا، نحن توضح كيفية استخدام التهاب الكبد الوبائي ه فيروس نانوحبيبات (هيفنب)، كبسولة ثيرانوستيك نمطي، كناقل توصيل متعددة الوظائف. وتشمل مهام هيفنبس استهداف الأنسجة وتصوير وتقديم العلاج. استناداً إلى بحوث هيفنب الهيكلية الراسخة، اختيرت بقايا مستقلة هيكلياً والمعرضة للسطح لاستبدال سيستئين كمواقع التصريف لمجموعات كيميائية ترتبط ماليميدي عن طريق الروابط ثيول انتقائية. سيستين واحد بعينه-تعديل هيفنب (Cys استبدال الهليونين في 573 aa (هيفنب-573 ج)) كان مترافق للثدي سرطان خلية محددة يجند، LXY30 وتسميته بالقرب من الأشعة تحت الحمراء (الجرد) الأسفار صبغ (Cy5.5)، التقديم الورم المستهدفة هيفنبس كبسولات التشخيصية الفعالة (LXY30-هيفنب-Cy5.5). يمكن أن تستخدم استراتيجيات هندسية مماثلة مع المجمعات الجزيئات الأخرى مع هياكل ذرية معروفة جيدا لاستكشاف تطبيقات محتملة في إيصال ثيرانوستيك.
Introduction
تطوير ناقلات نانو الحجم في إيصال التشخيصية والعلاجية، المعروفة باسم نانوثيرانوستيكس، حولت الكثير من ميدان الطب الحيوي بعيداً عن العلاجات معممة نحو التنفيذ الهادف1. تسليم نانوثيرانوستيك المستهدفة يدمج ناقلات نانو الحجم (nanoparticles) مع جزيئات ثيرانوستيك ستابلي توجيه الجزيئات ثيرانوستيك إلى أنسجة مريضة محددة أو المسارات البيوكيميائية2،3،4 . قد حان لطب النانوي في صدارة التنفيذ الهادف لأن جسيمات نانوية الحجم الأمثل لها القدرة على تحقيق استقرار الدورة الدموية لجزيئات ثيرانوستيك واستهداف جزيئات سطح الخلية المقدمة في الأنسجة المريضة بشكل انتقائي. لا تزال تعاني العديد من الأنظمة الأساسية نانوثيرانوستيك من امتصاص الخلية سلبية وتدهور ناضجة مسبقاً وسمية ورابطة غير كافية مع جزيئات ثيرانوستيك. فلبس التغلب على كثير من هذه العقبات في التنفيذ الهادف. فقد استخدمت نانوكاريرس لعرض الأجنبية [ابيتوبس] و/أو تسليم الجزيئات الصغيرة: نظام التي يمكن استخدامها لمكافحة العديد من الأمراض1. هذا التطبيق يعتمد أساسا على الخاصية التجميع الذاتي فضلا عن سهولة التعديلات الوراثية، لتحقيق التطبيق مصممة لعزام معطى. ومقارنة بالهندسة الوراثية، تصريف المواد الكيميائية من الببتيدات الأجنبية إلى عزام يعرض ميزة كبيرة لأنه يسمح بمجموعة كبيرة ومتنوعة من الكيانات، مثل الببتيدات أو oligosaccharides، يكون مترافق لسطح فلبس في التضمين و طريقة مرنة دون تغيير للجمعية عزام.
هيفنبس، المستمدة من البروتين قفيصه الهجينة المؤتلف، 2nd فتح قراءة الإطار (ORF2)، وهي غير معدية، تجميع ذاتي كابسيدس قادرة على ربط الخلايا وإدخال. نظراً لتطور الهجينة لانتقال الغشاء المخاطي، المثل مستقرة في ظروف المخاطية proteolytic وحمضيه5البروتين قفيصه المجمعة. هيفنبس تشكل جوفاء، T = 1 قفيصه icosahedral، تتألف من وحدات متطابقة 606،7 من ORF2، جعلها مستقرة جداً سواء في التخزين وفي ظروف قاسية الفسيولوجية. تفتقر إلى أي عناصر جينية فيروسية، يتحقق إنتاج فعالة وعالية الغلة من خلال نظام التعبير باكولوفيروس في خلايا الحشرات. بسبب استقرارها proteolytic، تستخرج هيفنبس الذاتي تجميعها وتنقيته من المادة طافية الخلية، خفض إلى حد كبير خطوات التنقية اللازمة. بالإضافة إلى ذلك، تمتلك هيفنبس نتوء مكشوفة سطح مجال (ف) متصلاً من خلال مفصل مرنة لقاعدة icosahedral مستقرة. المجال ف أشكال التموج المكشوفة السطح فوق قاعدة icosahedral بينما المفصل مرنة تجعل من الممكن تعديل المجال ف إلى حد كبير دون المساس بالهيكل الأساسي إيكوساهيدرال. مع الوحدات المتكررة 60، نتائج تعديل مواقع محددة واحدة في 60 موقعا متماثل للتحوير الكيميائي. في الآونة الأخيرة، وقد اقترحنا نانو-منصة استخدام هيفنب التي يمكن كيميائيا متزاوجة يغاندس أو الجزيئات الصغيرة للتطبيقات ثيرانوستيك. وتحقق ذلك باستبدال واحد من الأحماض الأمينية سيستين في مجال نتوء الهجينة-عزام كموقع رد فعل مع الببتيدات مرتبطة ماليميدي أو الجزيئات. استناداً إلى التحليل الهيكلي السابق عزام الهجينة ومدروسة مكسبه [ابيتوبس]8،9استعيض الأحماض الأمينية الهجينة-عزام الخمسة التالية مع سيستئين كمرشحين محتملين: Y485C، T489C، S533C، N573C، و T586C ( الشكل 1). وأكدت بها تشكيلات عزام بعد التعبير وتنقية من خلايا الحشرات، انتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM) المراقبة (الشكل 2)، والمواقع سيستين المكشوفة التي تم تحليلها بواسطة الغربية لطخة بعد البيوتين مرتبطة ماليميدي الاقتران (الشكل 2). بين طفرات الخمسة، ج هيفنب-573 عرض أقوى إشارة من تصريف ماليميدي-البيوتين (الشكل 2)، وكان يستخدم لمتابعة مظاهرة ك nanocarrier لخلايا سرطان الثدي تستهدف4 (الشكل 3).
ويصور هذا البروتوكول أساليب تصريف المواد الكيميائية لإرفاق جزيئات استهداف الورم هيفنبس عن طريق التصريف السطحي سيستين. نحن بالتفصيل على تصريف الورم الاستهداف والكشف عن الجزيئات لإيصال الورم مع المؤتلف هيفنبس التي تحتوي على سيستين في N573 (هيفنب-573C). ركزنا على انقر فوق كيمياء اقتران عملية من خطوتين لربط ورم سرطان الثدي تستهدف الببتيد، LXY3010 إلى هيفنبس بشكل LXY30-هيفنب (الشكل 4). وفي وقت لاحق، N-هيدروكسيسوكسيميدي (NHS)-كانت مترافق Cy5.5 إلى موقع Lys منفصلة في هيفنبس لبناء LXY30-هيفنب-Cy5.5 لكشف فلوري على حد سواء في المختبر (الشكل 5) و المجراة في4.
Protocol
Representative Results
Discussion
على النقيض من الإجراء يستغرق وقتاً طويلاً في مجال الهندسة الوراثية، التي عادة ما يستغرق أسابيع، هنا نظهر خطوتين بسيطة وإجراءات تصريف المواد الكيميائية خطوة واحدة، والتي يمكن أن تكتمل في غضون 3 أيام، إضافة السرطان استهداف يجند و/أو الأسفار صبغ الكشف عن مواقع Cys/ليز هيفنبس. يمكن استخدام هذا …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب نعترف بالرعاية من التمويل اللازم يستبدل بالمعاهد الوطنية للصحة منح #’ ق: AI095382، EB021230، CA198880، المعهد الوطني للأغذية والزراعة، فضلا عن البرنامج “أستاذ مرموق في فنلندا”.
Materials
| MINI Dialysis Units, 10K MWCO | Thermo Fisher Scientific | 69572 | mini dialysis unit |
| High Five Cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | Tn5 cells |
| SF9 Cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 cells |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Thermo Fisher Scientific | A11101, A11100 | Baculovirus expression system |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 | Bacmid |
| ESF921 Insect Cell Media | Expression Systems LLC | 96-001-01 | insect cell media |
| Cy5.5 NHS ester, 5mg | Lumiprobe Corp | 27020 | Cy5.5 NHS ester |
| Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL | Thermo Scientific | 87766 | spin desalting column |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich Chemical Co | M8250-250G | MES |
| Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes | Beckman Coulter, Inc | Depends on Rotor | ultracentrifuge tube |
| NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NPO321BOX | SDS protein gel |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | transfection reagent |
| EMS Glow Discharger | Electron Microscopy Science | glow discharger |
Referencias
- Ludwig, C., Wagner, R. Virus-like particles-universal molecular toolboxes. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).
- Galaway, F. A., Stockley, P. G. MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform. Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).
- Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. J. Virus-based nanocarriers for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 64 (9), 811-825 (2012).
- Chen, C. C., et al. Chemically activatable viral capsid functionalized for cancer targeting. Nanomedicine (Lond). 11 (4), 377-390 (2016).
- Jariyapong, P., et al. Chimeric hepatitis E virus-like particle as a carrier for oral-delivery. Vaccine. 31 (2), 417-424 (2013).
- Xing, L., et al. Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes. Virology. 265 (1), 35-45 (1999).
- Li, T. C., et al. Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 79 (20), 12999-13006 (2005).
- Xing, L., et al. Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway. J Biol Chem. 285 (43), 33175-33183 (2010).
- Xing, L., et al. Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain. J Virol. 85 (2), 1117-1124 (2011).
- Xiao, W., et al. Discovery and characterization of a high-affinity and high-specificity peptide ligand LXY30 for in vivo targeting of α3 integrin-expressing human tumors. EJNMMI research. 6 (1), (2016).
- Li, T. C., et al. Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 71 (10), 7207-7213 (1997).
- Peyret, H. A protocol for the gentle purification of virus-like particles produced in plants. J Virol Methods. 225, 59-63 (2015).
- Technologies, N. b. L. . Vol. MAN0007891 1-2. , (2013).
- Baskin, J. M., et al. Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).
