化学共轭法在戊型肝炎病毒纳米粒子表面功能化中的应用
Summary
我们已将戊型肝炎病毒的衣壳蛋白作为 theranostic 纳米微粒 (HEVNP) 进行了设计。HEVNP 自组装成一个稳定的 icosahedral 笼在黏膜分娩。在这里, 我们描述了 HEVNPs 的改变的肿瘤靶向性的变异表面暴露残留到半胱氨酸, 共轭合成配体, 具体绑定肿瘤细胞。
Abstract
病毒样粒子 (VLPs) 被用作 nanocarriers, 用于显示异物抗原和/或在各种疾病的检测和治疗中提供小分子。该应用依赖于基因修饰、自组装和半胱氨酸共轭来实现重组 VLPs 的肿瘤靶向应用. 与单基因修饰相比, 国外多肽对 VLPs 的化学共轭提供了一种很大的优势, 因为它允许多种实体, 如合成肽或寡糖, 以调制和灵活的方式共轭到 VLPs 表面, 而不改变 vip 组装。
在这里, 我们演示如何使用 E 型肝炎病毒纳米粒子 (HEVNP), 一个模块化的 theranostic 胶囊, 作为一个多功能运送载体。HEVNPs 的功能包括组织靶向、影像学和治疗性分娩。在 HEVNP 的结构研究基础上, 选取了结构上独立的和表面暴露的残留物作为 maleimide 连接化学基团的共轭点, 通过硫醇选择性的联系来选择半胱氨酸置换。一种特殊的半胱氨酸修饰 HEVNP (胱氨酸取代天门冬在 573 aa (HEVNP-573C)) 被共轭到乳腺癌细胞特异配体, LXY30 和标记为近红外线 (近红外) 荧光染料 (Cy5.5), 呈现肿瘤靶向HEVNPs 作为有效的诊断胶囊 (LXY30-HEVNP Cy5.5)。类似的工程策略可以与其他大分子复合物与众所周知的原子结构, 以探索潜在的应用 theranostic 交付。
Introduction
在治疗和诊断分娩中纳米载体的发展, 被称为 nanotheranostics, 已经把大部分生物医学领域从广义治疗转移到目标传递1。靶向 nanotheranostic 交付将纳米载体 (纳米粒子) 与 theranostic 分子结合在一起, 稳定地直接 theranostic 分子到特定患病组织或生物化学途径2,3,4.纳米医学已经走到了目标交付的前列, 因为最佳尺寸的纳米粒子有能力稳定 theranostic 分子的循环, 有选择地靶向细胞表面分子呈现在患病的组织上。许多 nanotheranostic 平台仍然遭受被动细胞吸收, 前成熟退化, 毒性和与 theranostic 分子不充分的联系。VLPs 克服了目标交付中的许多障碍。它们被用作 nanocarriers 来显示外来的表位和/或提供小分子: 一种可以用来对抗许多疾病的方案1。该应用主要依赖于自组装的特性以及遗传修饰的方便性, 以满足给定 vip 的设计应用。与基因工程相比, 国外多肽对 vip 的化学共轭显示了一个重要的优势, 因为它允许多种实体, 如多肽或寡糖, 被共轭到 VLPs 的表面, 在调制和灵活的方式, 不改变贵宾大会。
HEVNPs, 来自重组的混合动力衣壳蛋白, 2nd开放阅读框架 (ORF2), 是非传染性的, 自组装衣壳能够细胞结合和进入。由于混合动力汽车进化为黏膜传输, 组装的衣壳蛋白是同样稳定的水解和酸性粘膜条件5。HEVNPs 形成一个空心, T = 1 icosahedral 衣壳, 由60个相同的单位组成,6,7 ORF2, 使其在储存和严酷的生理条件下高度稳定。由于缺乏任何病毒遗传元素, 通过昆虫细胞的杆状病毒表达系统实现了高效、高产的生产。由于其蛋白水解稳定性, 自组装 HEVNPs 提取和纯化的细胞上清, 大大减少必要的净化步骤。此外, HEVNPs 拥有一个表面暴露的凸出域 (P 域) 通过一个灵活的铰链连接到一个稳定的 icosahedral 基础。p 域在 icosahedral 基础上形成表面暴露的尖峰, 而柔性铰链使得在不损害基 icosahedral 结构的情况下可以显著地修改 P 域。与60个重复的单位, 单一站点特定的修改结果在60个对称站点的化学调制。最近, 我们提出了一个纳米平台使用 HEVNP, 可以化学共轭配体或小分子的 theranostic 应用。这是通过取代单一氨基酸与半胱氨酸的突出领域的混合动力-vip 作为一个反应地点与 maleimide 链接的肽或分子。基于以前对混合动力-vip 和研究良好的免疫表位8,9的结构分析, 以下五个 hev-vip 氨基酸以半胱氨酸取代为潜在候选者: Y485C、T489C、S533C、N573C 和 T586C (图 1)。通过透射电镜 (TEM) 观察 (图 2) 对昆虫细胞的表达和纯化后的 vip 形成进行了验证, 并在 maleimide 链接生物素后对暴露的半胱氨酸部位进行了分析。共轭 (图 2)。在五变种人中, HEVNP-573C 显示了 maleimide-生物素共轭 (图 2) 的最强信号, 并被用来作为乳腺癌细胞靶向4 (图 3) nanocarrier 的后续演示。
该协议描述了化学共轭方法, 通过表面半胱氨酸共轭将肿瘤靶向分子附着在 HEVNPs 上。我们详细的肿瘤靶向和检测分子结合的肿瘤传递与重组 HEVNPs 含有半胱氨酸在 N573 (HEVNP-573C)。我们专注于两步点击化学共轭过程, 以绑定乳腺癌肿瘤靶向肽, LXY3010到 HEVNPs 形成 LXY30-HEVNP (图 4)。随后, n-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 被共轭到单独的赖氨酸站点在 HEVNPs 建立 LXY30 HEVNP-Cy5.5 为荧光检测的在体外(图 5) 和在体内4.
Protocol
Representative Results
Discussion
与耗时的基因工程程序, 这通常需要几个星期, 在这里我们演示简单的两步和一步化学共轭程序, 可以在3天内完成, 增加癌症靶向配体和/或荧光检测染料到胱氨酸/赖氨酸 HEVNPs 的部位。该技术可用于筛选候选池中的最佳配体目标, 从而在合理的成本和交付时间内利用可用的肽/小分子合成服务。
不同于传统的基因工程, 它只能将多肽插入到感兴趣的蛋白质中, 化学共轭可以将各种…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
提交人承认, 资助 RHC 由 NIH 赠款 # 的 AI095382, EB021230, CA198880, 国家粮食和农业研究所, 以及芬兰杰出的教授计划。
Materials
| MINI Dialysis Units, 10K MWCO | Thermo Fisher Scientific | 69572 | mini dialysis unit |
| High Five Cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | Tn5 cells |
| SF9 Cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 cells |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Thermo Fisher Scientific | A11101, A11100 | Baculovirus expression system |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 | Bacmid |
| ESF921 Insect Cell Media | Expression Systems LLC | 96-001-01 | insect cell media |
| Cy5.5 NHS ester, 5mg | Lumiprobe Corp | 27020 | Cy5.5 NHS ester |
| Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL | Thermo Scientific | 87766 | spin desalting column |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich Chemical Co | M8250-250G | MES |
| Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes | Beckman Coulter, Inc | Depends on Rotor | ultracentrifuge tube |
| NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NPO321BOX | SDS protein gel |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | transfection reagent |
| EMS Glow Discharger | Electron Microscopy Science | glow discharger |
Referencias
- Ludwig, C., Wagner, R. Virus-like particles-universal molecular toolboxes. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).
- Galaway, F. A., Stockley, P. G. MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform. Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).
- Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. J. Virus-based nanocarriers for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 64 (9), 811-825 (2012).
- Chen, C. C., et al. Chemically activatable viral capsid functionalized for cancer targeting. Nanomedicine (Lond). 11 (4), 377-390 (2016).
- Jariyapong, P., et al. Chimeric hepatitis E virus-like particle as a carrier for oral-delivery. Vaccine. 31 (2), 417-424 (2013).
- Xing, L., et al. Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes. Virology. 265 (1), 35-45 (1999).
- Li, T. C., et al. Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 79 (20), 12999-13006 (2005).
- Xing, L., et al. Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway. J Biol Chem. 285 (43), 33175-33183 (2010).
- Xing, L., et al. Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain. J Virol. 85 (2), 1117-1124 (2011).
- Xiao, W., et al. Discovery and characterization of a high-affinity and high-specificity peptide ligand LXY30 for in vivo targeting of α3 integrin-expressing human tumors. EJNMMI research. 6 (1), (2016).
- Li, T. C., et al. Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 71 (10), 7207-7213 (1997).
- Peyret, H. A protocol for the gentle purification of virus-like particles produced in plants. J Virol Methods. 225, 59-63 (2015).
- Technologies, N. b. L. . Vol. MAN0007891 1-2. , (2013).
- Baskin, J. M., et al. Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).
