Oberfläche Funktionalisierung der Hepatitis E Virus Nanopartikel chemische Konjugation Methoden
Summary
Wir haben das Kapsid Protein von Hepatitis E Virus als Theranostik Nanopartikel (HEVNP) entwickelt. HEVNP montiert selbst in einen stabilen ikosaedrischen Käfig in Schleimhaut Lieferung. Hier beschreiben wir die Änderung des HEVNPs für Tumor gezielt durch Mutationen Oberfläche ausgesetzt Rückstände, Cysteine, die synthetische Liganden konjugieren, die Tumorzellen gezielt zu binden.
Abstract
Virusähnliche Partikel (untersuchten) wurden zur als darin ausländische Epitope Anzeige und/oder kleine Moleküle bei der Erkennung und Behandlung von verschiedenen Krankheiten zu liefern. Diese Anwendung basiert auf gentechnische Veränderung, Selbstmontage und Cystein Konjugation erfüllen die Tumor-targeting Anwendung der rekombinanten untersuchten. verglichen mit genetischen Modifikation allein, chemische Konjugation von fremden Peptiden, untersuchten bietet eine erheblichen Vorteil, weil es eine Vielzahl von Einrichtungen wie synthetische Peptide oder Oligosaccharide, um an die Oberfläche des untersuchten eine flexibel und moduliert und ohne Änderung der Assemblée VLP konjugiert werden können.
Hier zeigen wir wie das Hepatitis E Virus Nanopartikel (HEVNP), eine modularisierte Theranostik-Kapsel als multifunktionale Anlieferung Träger verwenden. Aufgaben des HEVNPs gehören Gewebe-targeting, Bildgebung und therapeutische Lieferung. Basierend auf den etablierten Strukturforschung HEVNP, wurden die strukturell unabhängige und Oberfläche ausgesetzt Rückstände für Cystein Ersatz als Konjugation Standorte für Maleimide verbunden chemische Gruppen über Thiol-selektive Verbindungen ausgewählt. Eine besondere Cystein-modifizierte HEVNP (Cys Ersatz von Asparagin bei 573 aa (HEVNP – 573C)) war konjugiert, eine Brust Krebs Zelle-spezifische Liganden, LXY30 und beschriftet mit Nah-Infrarot (NIR) Fluoreszenz-Farbstoff (Cy5.5), Rendern den Tumor gezielt HEVNPs als effektive diagnostische Kapseln (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Ähnliche technische Strategien können mit anderen makromolekulare Komplexe mit bekannten Atomstrukturen eingesetzt werden, Anwendungsmöglichkeiten im Theranostik Lieferung zu erkunden.
Introduction
Die Entwicklung der nanogrösse Vektoren in therapeutische und diagnostische Lieferung, bekannt als Nanotheranostics, hat viel von der Biomedizin vom generalisierten Behandlungen gegen gezielte Bereitstellung1verschoben. Gezielte Nanotheranostic Lieferung integriert nanogrösse Vektoren (Nanopartikel) mit Theranostik Moleküle stabil Theranostik-Moleküle zu einem bestimmten erkranktem Gewebe oder biochemischen Weg2,3,4 direkt . Nanomedizin ist an die Spitze der gezielte Bereitstellung gekommen, weil optimal dimensionierte Nanopartikel haben die Fähigkeit zur Auflage von Theranostik Moleküle stabilisieren und selektiv Ziel Zelle Oberfläche Moleküle präsentiert auf krankem Gewebe. Viele Nanotheranostic Plattformen leiden noch unter passive Zelle Aufnahme, vorzeitigen Abbau, Toxizität und unzureichende Verbindung mit Theranostik Moleküle. Untersuchten überwinden viele dieser Hindernisse in gezielte Bereitstellung. Sie dienten als darin zu ausländischen Epitope Anzeige und/oder kleine Moleküle liefern: eine Therapie, die gegen viele Krankheiten1eingesetzt werden kann. Diese Anwendung beruht hauptsächlich auf dem Gelände des Self-assembly sowie die Leichtigkeit der genetischen Veränderungen, die entworfene Anwendung für die gegebenen VLP zu erfüllen. Im Vergleich zu Gentechnik, chemische Konjugation von ausländischen Peptide, VLP zeigt einen deutlichen Vorteil, da es eine Vielzahl von Einrichtungen wie Peptide oder Oligosaccharide, um an der Oberfläche des untersuchten in einer modulierten konjugiert werden kann und flexibel ohne Änderung des VLP-Montage.
HEVNPs, abgeleitet aus der rekombinanten Proteins HEV Kapsid, 2Nd offen lesen Frame (ORF2), sind nicht ansteckend, selbst Montage Capsids fähig Zelle-Bindung und Eintrag. Weil HEV für Schleimhaut Getriebe entwickelt, ist das montierte Kapsid Protein in proteolytischen und sauren Schleimhaut Bedingungen5ähnlich stabil. HEVNPs bilden eine Mulde, T = 1 ikosaedrischen Kapsid, bestehend aus 60 identischen Einheiten6,7 der ORF2, Rendern hochstabile sowohl im harten physiologischen Bedingungen im Speicher. Alle viralen genetischen Elemente fehlen, wird die Produktion effizienter, ertragreich durch Baculovirus Expressionssystems in Insektenzellen erreicht. Wegen ihrer proteolytischen Stabilität sind selbstgebaute HEVNPs extrahiert und gereinigt aus Zelle überstand, notwendigen Reinigungsschritte erheblich zu reduzieren. Darüber hinaus besitzen HEVNPs eine Oberfläche exponierten Vorsprung Domäne (P Domäne) durch ein flexibles Scharnier zu einer stabilen ikosaedrischen Basis verbunden. Die P-Domäne bildet Oberfläche ausgesetzt Spikes auf der ikosaedrischen Basis, während das flexible Gelenk es möglich macht, wesentlich die P-Domäne zu ändern, ohne Kompromisse bei der ikosaedrischen Basisstruktur. Mit 60 wiederholte Einheiten führt einzelne standortspezifische Modifikation 60 symmetrischen Seiten für chemische Modulation. Vor kurzem vorgeschlagen wir eine Nano-Plattform mit HEVNP, die chemisch Liganden oder kleine Moleküle für Theranostik Anwendungen konjugieren kann. Dies wurde erreicht, indem eine einzelne Aminosäure mit Cystein in der Vorwölbung Domain der HEV-VLP als Reaktion Site mit Maleimide verknüpft Peptide oder Moleküle. Basierend auf früheren Strukturanalyse von HEV-VLP und gut untersuchte immunogen Epitope8,9, wurden die folgenden fünf HEV-VLP-Aminosäuren als potenzielle Kandidaten mit Cystein ersetzt: Y485C, T489C, S533C, N573C und T586C ( Abbildung 1). Nach Ausdruck und Reinigung von Insektenzellen, wurden ihre VLP-Formationen durch Übertragung Elektronenmikroskopie (TEM) Beobachtung (Abbildung 2) bestätigt, und die exponierten Cystein Websites analysiert wurden durch Western blot nach Maleimide-linked Biotin Konjugation (Abbildung 2). Unter den fünf Mutanten HEVNP – 573C angezeigt das stärkste Signal des Maleimide-Biotin Konjugation (Abbildung 2) und diente zur Follow-up-Demonstration als die Nanocarrier für Brust Krebszelle gezielt4 (Abbildung 3).
Dieses Protokoll stellt chemische Konjugation Methoden zur Tumor-targeting Moleküle durch Oberfläche Cystein Konjugation HEVNPs beimessen. Wir ausführlich die Konjugation der Tumor targeting und Erkennung Moleküle für Tumor-Lieferung mit rekombinanten HEVNPs mit Cystein bei N573 (HEVNP – 573C). Wir konzentrieren auf Klick Chemie Konjugation Schritten, einen Brust-Krebs-Tumor gezielt Peptid, LXY3010 , HEVNPs Form LXY30-HEVNP (Abbildung 4) zu binden. Anschließend, N-Hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 wurden auf die separate Lys-Website auf HEVNPs LXY30-HEVNP-Cy5.5 für Fluoreszenz-Detektion sowohl in Vitro (Abbildung 5) bauen konjugiert und in-vivo4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Im Gegensatz zu der Zeit raubende Gentechnik-Verfahren, das dauert in der Regel Wochen zeigen wir hier in zwei einfachen Schritten und einstufige chemische Konjugation Verfahren, die innerhalb von 3 Tagen des Hinzufügens des Krebs gezielt Liganden abgeschlossen werden können und/oder Fluoreszenz-Erkennung zu Cys/Lys Seiten HEVNPs Farbstoff. Die Technik kann verwendet werden zum Bildschirm für die beste Liganden Ziel aus einem Pool von Kandidaten und damit nutzt die verfügbaren Peptid/kleine Molekül Synthese Dienste …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren erkennen die Patenschaft der Finanzierung zum RHC von NIH gewähren #’ s: AI095382, EB021230, CA198880, Nationales Institut für Ernährung und Landwirtschaft sowie Finnland Distinguished Professor Programm.
Materials
| MINI Dialysis Units, 10K MWCO | Thermo Fisher Scientific | 69572 | mini dialysis unit |
| High Five Cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | Tn5 cells |
| SF9 Cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 cells |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Thermo Fisher Scientific | A11101, A11100 | Baculovirus expression system |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 | Bacmid |
| ESF921 Insect Cell Media | Expression Systems LLC | 96-001-01 | insect cell media |
| Cy5.5 NHS ester, 5mg | Lumiprobe Corp | 27020 | Cy5.5 NHS ester |
| Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL | Thermo Scientific | 87766 | spin desalting column |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich Chemical Co | M8250-250G | MES |
| Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes | Beckman Coulter, Inc | Depends on Rotor | ultracentrifuge tube |
| NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NPO321BOX | SDS protein gel |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | transfection reagent |
| EMS Glow Discharger | Electron Microscopy Science | glow discharger |
Referencias
- Ludwig, C., Wagner, R. Virus-like particles-universal molecular toolboxes. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).
- Galaway, F. A., Stockley, P. G. MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform. Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).
- Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. J. Virus-based nanocarriers for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 64 (9), 811-825 (2012).
- Chen, C. C., et al. Chemically activatable viral capsid functionalized for cancer targeting. Nanomedicine (Lond). 11 (4), 377-390 (2016).
- Jariyapong, P., et al. Chimeric hepatitis E virus-like particle as a carrier for oral-delivery. Vaccine. 31 (2), 417-424 (2013).
- Xing, L., et al. Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes. Virology. 265 (1), 35-45 (1999).
- Li, T. C., et al. Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 79 (20), 12999-13006 (2005).
- Xing, L., et al. Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway. J Biol Chem. 285 (43), 33175-33183 (2010).
- Xing, L., et al. Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain. J Virol. 85 (2), 1117-1124 (2011).
- Xiao, W., et al. Discovery and characterization of a high-affinity and high-specificity peptide ligand LXY30 for in vivo targeting of α3 integrin-expressing human tumors. EJNMMI research. 6 (1), (2016).
- Li, T. C., et al. Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 71 (10), 7207-7213 (1997).
- Peyret, H. A protocol for the gentle purification of virus-like particles produced in plants. J Virol Methods. 225, 59-63 (2015).
- Technologies, N. b. L. . Vol. MAN0007891 1-2. , (2013).
- Baskin, J. M., et al. Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).
