In Vivoモデル システムとしてゼブラフィッシュを用いた DNA 複製タイミングのプロファイリング
Summary
ゼブラフィッシュは、開発中に DNA 複製タイミングを勉強する体内モデル システムとして最近使用されました。ここでは、プロファイル レプリケーション タイミングにゼブラフィッシュ胚を使用してのためのプロトコルの詳細。このプロトコルは、変異体、個々 の細胞の種類、病モデル、および他の種にレプリケーション タイミングを勉強する簡単に適合できます。
Abstract
DNA 複製タイミングが重要な携帯電話の特性、クロマチン構造、転写、DNA 突然変異率と有意な関係を展示です。がん、開発中に発生するレプリケーションのタイミングの変化、発展に果たしている役割のレプリケーション タイミングと疾患は知られていません。ゼブラフィッシュを最近レプリケーションのタイミングを研究する体内モデル システムとして開設ここでは、ゼブラフィッシュを使用して DNA 複製タイミングを判断するプロトコルの詳細。アダルト ゼブラフィッシュ胚から細胞を並べ替え後、次世代シーケンス データの解析による DNA コピー数の変化を調べることによって高解像度ゲノム DNA 複製タイミングのパターンを構築できます。ゼブラフィッシュ モデル システムでは、レプリケーションのタイミング変更、開発全体を通して体内に発生し、個々 の細胞の種類、病モデル、または突然変異系統の変化を評価するためにも使用できます評価ができます。これらのメソッドが開発中に機構と複製タイミングの確立と維持の決定要因を調査し、研究を有効にすると、突然変異と腫瘍形成、摂動の効果を果たしている役割のレプリケーション タイミング開発と疾患にレプリケーション タイミング。
Introduction
正常に分裂する細胞、彼らする必要があります最初正確かつ忠実に複製の全体のゲノム。再現パターンは、DNA 複製タイミングのプログラム1として知られているゲノム重複が発生します。DNA 複製タイミングのクロマチン組織、エピゲノム、遺伝子表現2,3と相関しています。レプリケーションのタイミングの変更、開発全体を通して発生して転写に大幅に関連するプログラムとクロマチン マークと組織4,5に変更。さらにレプリケーション タイミングが変異の頻度と相関して、タイミングの変化が癌6,7,8の様々 なタイプ。これらの観測にもかかわらずメカニズムとレプリケーション タイミング設立と規制の要因はまだほとんど分かっていないとそれが開発に果たす役割と病気は断固としたではないです。さらに、ゲノム全体のレプリケーションでは最近まで脊椎動物の開発中に発生する変更のタイミングのみ検討されていた細胞モデルに。
哺乳類の開発9、多くの類似点と急速に開発の胚の数百のもたらすことができる一つの交配組み合わせ、ゼブラフィッシュ、動脈分布開発中にレプリケーション タイミング生体内研究に適して 10。さらに、ゼブラフィッシュの開発を通して細胞周期、クロマチン組織および DNA 複製タイミング11との関係を共有する転写プログラムに変更があります。ゼブラフィッシュは、また優秀な遺伝モデル、彼らは標的突然変異、突然変異、遺伝子導入による操作に特に適しているし、遺伝的画面は脊椎動物の発生12に必要な多くの遺伝子を識別しました。したがって、ゼブラフィッシュは、複製タイミングの確立と維持に関与する遺伝子を識別するために、脊椎動物の発生にレプリケーション タイミングを規制緩和の効果を確認する使用できます。トランスジェニックは行は、異なる発達縦長や病状を分離した個々 のセルの種類からのレプリケーション タイミングを評価するために使用できます。重要なは、人間の病気病気の形成と進展9,13,14にレプリケーション タイミングの役割を調査するための様々 なゼブラフィッシュ モデルがあります。
最近では、最初のレプリケーション タイミング プロファイルは、ゼブラフィッシュ、複製を生体内で15のタイミングを研究するモデル システムとして確立することから生成されました。これを達成するためには、アダルト ゼブラフィッシュから分離された細胞型、開発の複数の段階でゼブラフィッシュ胚から細胞を採取されました。セルされた FACS (蛍光活性化細胞ソーティング) DNA の内容に基づいて G1、S 相の個体群を分離するによって並べ替えられます。G1 のサンプルを使用すると、コピー数コントロールとして、S 相集団でコピー数変異が決定され、相対のレプリケーション タイミング16を推測するために使用します。レプリケーションのタイミングの変化が直接比較発達の異なるサンプルやセルの種類間、これは生体内で脊椎動物全体で発生するレプリケーションのタイミングで変更を確認する使用されました。このメソッドは、チミジン類似体や免疫沈降 DNA4,6のラベル表示は必要ありませんが、他のゲノムの方法に比べていくつかの利点を主に提供します。
ここでは、プロファイル ゲノム DNA 複製タイミングの時にプロトコルの詳細なゼブラフィッシュの高解像度。これらのプロトコルは、開発中に発生するこれらの関係の変化のプロファイリングと同様、ゼブラフィッシュ ゲノム ゲノムとエピジェネティックな特徴との関係を決定するために使用されています。これらのプロトコルは、ゼブラフィッシュ突然変異系統と疾患モデルにレプリケーション タイミングの変化を勉強するも簡単に合わせられます。さらに、これらのメソッドは、ゼブラフィッシュから個々 のセルの種類を第 1 のソートによって特定のセルタイプにレプリケーション タイミングを勉強する時に拡張できる基盤を提供します。ゼブラフィッシュは、生体内で優れたモデル システムとしてレプリケーションのタイミングを研究し、最終的にこの重要なエピジェネティック特性の生物学的機能を明らかにする使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ゼブラフィッシュでは、DNA 複製タイミングを勉強する新しい、ユニークな体内モデル システムを提供します。時限を行うときはこの実験的プロトコルの詳細は、その胚の何千もを実験のため 1 日で集めることができます。これらの胚は、開発の正確にタイミングとはっきりと特徴付けられる段階を通じて同期的に開発します。ゼブラフィッシュは、ゼブラフィッシュ胚は外部開発、?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業によって支えられた国立医学研究所全般を通じて健康の国民の協会の 5P20GM103636-02 (フローサイトメトリー コア サポートを含む) と 1R01GM121703、助成金し、同様、オクラホマ センターから成体幹細胞のための賞研究。
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
Referencias
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