Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil
Summary
Zebrafish recentemente foram usados como um sistema de modelo na vivo para estudar tempo de replicação do ADN durante o desenvolvimento. Aqui está detalhado os protocolos para o uso de embriões de peixe-zebra para sincronismo de replicação de perfil. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar tempo de replicação em mutantes, tipos de células individuais, modelos de doença e outras espécies.
Abstract
Sincronismo de replicação do DNA é uma característica importante do celular, exibindo relacionamentos significativos com taxas de mutação do DNA, transcrição e estrutura da cromatina. Alterações no calendário de replicação ocorrerem durante o desenvolvimento e no câncer, mas o tempo de replicação do papel que desempenha no desenvolvimento e doença não é conhecida. Zebrafish estabeleceram-se, recentemente, como um sistema de modelo na vivo para estudar tempo de replicação. Aqui está detalhado os protocolos para usando o zebrafish para determinar o tempo de replicação do DNA. Depois da classificação de células de embriões e adultos do zebrafish, padrões de tempo de replicação de DNA de alta resolução todo o genoma podem ser construídos, determinando alterações no número de cópia de DNA através da análise de dados de sequenciamento na próxima geração. O sistema de modelo zebrafish permite avaliar as mudanças de tempo de replicação que ocorrem in vivo durante todo o desenvolvimento e também pode ser usado para avaliar as mudanças nos tipos de células individuais, modelos de doença ou linhas mutantes. Esses métodos permitirá estudos investigando os mecanismos e os determinantes de estabelecimento de calendário de replicação e manutenção durante o desenvolvimento, o tempo de replicação papel joga em mutações e tumorigênese e os efeitos de distorçer tempo de replicação sobre desenvolvimento e doença.
Introduction
Para as células dividir com sucesso, eles devem primeiro com precisão e fielmente replicar seu genoma inteira. Duplicação do genoma ocorre em um padrão reproduzível, conhecido como o DNA replicação sincronismo programa1. Sincronismo de replicação de DNA está correlacionado com a organização da cromatina, marcas epigenéticas e expressão de gene2,3. Alterações no calendário de replicação ocorrerem durante todo o desenvolvimento e estão significativamente relacionados com transcriptional programas e alterações de marcas da cromatina e organização4,5. Além disso, sincronismo de replicação está correlacionado com frequências mutacional e alterações no calendário são observadas em vários tipos de câncer,6,7,8. Apesar destas observações, os mecanismos e os determinantes de estabelecimento de calendário de replicação e Regulamento ainda são em grande parte desconhecidos e o papel que desempenha no desenvolvimento e doença é indeterminada. Além disso, até recentemente a replicação do genoma-largo cronometrar as mudanças que ocorrem durante todo o desenvolvimento de vertebrados tinha apenas sido examinada em modelos de cultura de células.
Peixe-zebra, Danio rerio, são adequados para estudar replicação sincronismo na vivo durante o desenvolvimento, como um único par de acasalamento pode render centenas de embriões que se desenvolvem rapidamente com muitas semelhanças com o desenvolvimento dos mamíferos9, 10. Além disso, durante todo o desenvolvimento do zebrafish, existem alterações ao ciclo celular, organização da cromatina e programas transcriptional que compartilham relações com DNA replicação sincronismo11. Zebrafish também são um excelente modelo genético, como eles são particularmente passíveis de manipulação por transgênese, mutagênese e alvo de mutações, e telas genéticas identificaram diversos genes necessários para o desenvolvimento de vertebrados12. Portanto, o zebrafish pode ser usado para identificar genes envolvidos na manutenção e criação de temporização de replicação e para observar os efeitos da desregulamentação timing de replicação em desenvolvimento de vertebrados. Linhas transgénicas também podem ser usadas para avaliar o tempo de replicação da célula individual tipos isolados em diferentes momentos do desenvolvimento ou em condições de doença. Importante, existem vários modelos de zebrafish de doenças humanas que podem ser usados para investigar o papel do sincronismo de replicação em doença formação e progressão9,13,14.
Recentemente, os perfis de tempo de replicação primeiros foram gerados de zebrafish, estabelecendo isso como um sistema modelo para estudar a replicação sincronismo na vivo15. Para fazer isso, as células foram coletadas de zebrafish embriões em vários estágios de desenvolvimento e em um tipo de células isoladas de zebrafish adulto. As células foram então classificadas por FACS (classificação de fluorescência-ativado da pilha) com base no conteúdo de DNA para isolar populações de fase G1 e S. Usando o exemplo do G1 como um controle de número de cópia, copie o números variações na fase S populações foram determinadas e usadas para inferir a replicação relativo tempo16. Alterações no calendário de replicação em seguida podem ser directamente comparadas entre diferentes amostras de desenvolvimento e tipos de células, e isso foi usado para determinar mudanças no calendário de replicação que ocorrem na vivo durante todo o desenvolvimento de vertebrados. Este método oferece diversas vantagens sobre outros métodos de genômicas, principalmente que não exige rotulagem com análogos da timidina ou imunoprecipitação de DNA4,6.
Aqui está detalhado os protocolos para sincronismo de replicação de DNA de todo o genoma de perfil de alta resolução no zebrafish. Estes protocolos têm sido utilizados para determinar as relações com recursos de genômicas e epigenéticas no genoma de zebrafish, bem como alterações nesses relacionamentos que ocorrem durante todo o desenvolvimento de criação de perfil. Estes protocolos são também facilmente adaptados para estudar alterações no calendário de replicação em cepas mutantes de zebrafish e nos modelos de doença. Além disso, esses métodos fornecem uma base que pode ser expandida em cima para estudar tempo de replicação em tipos de células específicas, classificando primeiro os tipos de célula individual do zebrafish. O zebrafish pode servir como um excelente na vivo sistema modelo para estudar o tempo de replicação e, finalmente, revelar as funções biológicas dessa importante característica epigenética.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafish fornecem um sistema de modelo novo e exclusivo na vivo para estudar tempo de replicação do DNA. Quando cronometrados acasalamentos são realizados como detalhado no presente protocolo experimental, milhares de embriões podem ser coletados em um único dia para experimentos. Esses embriões se desenvolvem sincronicamente por precisamente cronometrados e distintamente caracterizados estágios de desenvolvimento. Zebrafish pode ser facilmente e com precisão encenado por morfologia usando um estereomic…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de General Medical Ciências do National Institutes of Health, através de concede 5P20GM103636-02 (incluindo suporte de núcleo de citometria de fluxo) e 1R01GM121703, bem como prêmios do centro de Oklahoma para células-tronco adultas Pesquisa.
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
Referencias
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