Konfokale Mikroskopie zeigt Zelle Oberfläche Rezeptor Aggregation über Bild Korrelation Spektroskopie

Summary

Antikörper, die Ziel-Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden können Konformation und clustering Veränderungen verleihen. Diese dynamischen Veränderungen haben Auswirkungen für die Charakterisierung von Arzneimittelentwicklung in Zielzellen. Dieses Protokoll nutzt konfokalen Mikroskopie und Bild Korrelation Spektroskopie durch ImageJ/Fidschi, das Ausmaß des Rezeptors auf der Zelloberfläche clustering zu quantifizieren.

Abstract

Konfokale Mikroskopie bietet eine zugängliche Methode zur subzelluläre Interaktionen entscheidend für die Charakterisierung und Weiterentwicklung der präklinischen Agenten beschriftet mit fluoreszierenden Sonden zu erfassen. Mit neuen Zuführungen in Antikörper-basierte zytotoxischen Droge ist Trägersysteme, Verständnis der Veränderungen induziert durch diese Mittel im Bereich der Rezeptor-Aggregation und Internalisierung von entscheidender Bedeutung. Dieses Protokoll nutzt die etablierten Verfahren der fluoreszierenden Immunocytochemistry und die open-Source Fidschi Verteilung von ImageJ, mit seinen eingebauten Autokorrelation und Bild mathematische Funktionen, räumliche Bildkorrelation durchführen Spektroskopie (ICS). Dieses Protokoll quantitates die fluoreszente Intensität der beschrifteten Rezeptoren als Funktion des Gebiets Strahl confocal Mikroskop. Dies bietet ein quantitatives Maß für den Zustand der Ziel-Molekül Aggregation auf der Zelloberfläche. Diese Methode konzentriert sich auf die Charakterisierung der statischen Zellen mit Potenzial in zeitlichen Untersuchungen der Rezeptor Aggregation zu expandieren. Dieses Protokoll stellt eine zugänglich Methode zur Quantifizierung der clustering-Ereignisse an der Zelloberfläche gut nutzen Techniken und nicht-spezialisierten bildgebenden Geräte eingerichtet bieten.

Introduction

Die Entwicklung von therapeutischen Antikörpern hat bemerkenswerte Erfolge bei der Behandlung von mehreren Tumor Arten¹gezeigt. Die jüngsten Fortschritte der Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADC) Oberfläche als Bereitstellungsmechanismen für Zytotoxische Substanzen erweitert die Anforderungen für das Verständnis der Dynamik der Antikörper: Rezeptor-Wechselwirkungen auf der Zelle². Im Anschluss an die erfolgreiche Ausrichtung eines Antikörpers an die Zelle Oberfläche Rezeptor können diese komplexe ähnliche Aggregation Muster bei Ligand: Antikörper Interaktionen³induzieren. Veränderungen im Rezeptor Aggregation können Änderungen an der Membran und führen die Internalisierung der Rezeptor und seine Entfernung von der Zelloberfläche induzieren. Im Rahmen einer Antikörper-Wirkstoff-Konjugate löst dabei anschließend die zytotoxische Nutzlast in verinnerlichten Endosomen und anschließend das Zytoplasma, wodurch effektive Zelle Tötung.

Konfokale Mikroskopie hat ein wirksames Mittel zur Visualisierung dieser wichtigen Wechselwirkungen von Antikörpern und ihre Ziel-Rezeptoren⁴zur Verfügung gestellt. Um die Änderungen der Aggregation des Zielmoleküls an der Zelloberfläche erkunden nutzt dieses Protokoll Nachbearbeitung der konfokalen Mikroskopie Bilder über ein räumliches Bild Korrelation Spektroskopie (ICS) Technik ^5,6,7 .

Die Stiftung der Bild Korrelation Spektroskopie ist die Beobachtung, dass räumliche Fluoreszenz intensitätsschwankungen eine Beziehung in der Dichte und Aggregation Zustand der beschrifteten Strukturen teilen. Diese Beziehung wird nach der Berechnung einer räumlichen Autokorrelation Funktion eines aufgenommenen Bildes⁵hergestellt.

Alle Varianten des Bildes Korrelation Spektroskopie erfordern die Berechnung der Autokorrelation ein Bild. Danach erfolgt durch den Einbau dieser Funktion zu einer zweidimensionalen Gaußschen Kurve für die Extraktion von quantitativen Aggregation Zustandsparameter innerhalb des Abbilds. In einfachen Worten die Berechnung eines Bildes Autokorrelation erfolgt ein Vergleich alle Paare möglich Pixel innerhalb eines Abbilds und Berechnung der Wahrscheinlichkeit, dass beide gleich hell wie jeder andere. Dies wird als eine Funktion des Abstandes und Richtungen der Pixel Trennung⁸visualisiert.

Der theoretische Rahmen für das Bild Korrelation Spektroskopie gegründet und von Petersen und Wiseman Et al.definiert. ^{5 , 6}. in diesem Protokoll sind die Autokorrelation Berechnungen in Fidschi/ImageJ sowie einem Tabellenkalkulationsprogramm, die Grundlage für die Intensität Fluktuation räumliche Autokorrelationsfunktion kann als (Eq 1)beschrieben werden:

     

wobei F die Fourier-Transformation darstellt; F⁻¹ die Inverse Fourier transformieren; F * seine konjugiert Komplex; und die räumlichen Sträfling Variablen ε und η. In räumlichen ICS kann wie in diesem Protokoll beschrieben die Autokorrelationsfunktion berechnet werden mit einer 2D schnelle Fourier-Transformation Algorithmus^7,9. Die Autokorrelation bei Null räumliche Trennung bekannt als NULL-Verzögerung, g₁₁(0,0), bietet die inverse mittlere Anzahl von Partikeln pro Strahl Bereich des Mikroskops. Es kann durch den Einbau der räumlichen Autokorrelationsfunktion auf eine zweidimensionale Gaußsche Funktion (Eq 2)bezogen werden:

     

Da die Pixel in einem Bild erfasst innerhalb eines festgelegten Bereichs enthalten sind und diese Messungen nicht bis ins Unendliche zu verlängern, wird der Begriff G∞ als Offset verwendet, um Langstrecken räumliche Zusammenhänge innerhalb des Abbilds zu berücksichtigen. Für Molekulare Größe Aggregate ω ist die Point-Spread Funktion des Mikroskops und durch die durchgehenden Hälfte-höchstens der räumlichen Autokorrelationsfunktion beschrieben. Der Bereich innerhalb der Point-spread-Funktion des Gerätes kann durch den Einsatz von Sub-Auflösung fluoreszierenden Perlen kalibriert werden.

Für das Bild Korrelation Spektroskopie Protokoll beschriebenen Autokorrelation und mathematische Funktionen erforderlich, um ICS zu vervollständigen erfolgt über das Open-Source-Imaging-Verarbeitung-Plattform, Fidschi¹⁰, eine Verteilung der ImageJ Programm^11,12. Fiji/ImageJ nutzt die vorinstallierte schnelle Fourier-Transformation in das FFT mathematische Funktion. Diese Funktion reduziert die Rechenzeit benötigt dieser Berechnung durch die Reduzierung der Datenbereich um einen Faktor von zwei in jeder Dimension¹³. Wie die 2D Autokorrelationsfunktion ungefähr symmetrisch in X, y-Achse, ist kann ein einzelnes Profil Liniendiagramm durch Autokorrelation Bild verwendet werden, um die rohen Autokorrelation in Abhängigkeit von der räumlichen Lag zu messen. NULL-Verzögerung Lärm wird vor weiteren Berechnung, mit der sich daraus ergebenden Autokorrelation Amplitude (Spitzenwert, g(0)_T) korrigiert für den Hintergrund mit dem Ausdruck (Eq 3)entfernt:

     

wo ich_b ist die mittlere Intensität aus einer Hintergrund-Region mit Ausnahme der Zelle. Die Cluster-Dichte oder Dichte von fluoreszierenden Objekten wird durch (Eq 4)definiert:

    

In dem hier beschriebenen Protokoll fördern wir einfach die Berechnung der Dichte Cluster (CD), unter der Annahme, basierend auf der Beobachtung, die einer normierten Autokorrelationsfunktion auf einen Wert nähert sich 1.0 mit zunehmender räumlicher Verzögerung zerfallen wird. Mit maximale räumliche Lag, gibt es nicht mehr eine Korrelation der Fluoreszenz Intensitätswerte und somit ohne eine Korrelation sind die Berechnungen in dieser Region computing den Wert einer Intensität multipliziert mit dieser Intensität, die anschließend durch geteilt wird die Quadrat der, dass die Intensität, die definitionsgemäß 1,0 entspricht. Cluster-Dichte von einem normierten Autokorrelationsfunktion kann so berechnet werden, durch Subtraktion 1.0 von der normierten Autokorrelationsfunktion vor der Einnahme ihren gegenseitigen (Eq-5):

     

Weitere Kalibrierung des Bereichs Strahl kann durchgeführt werden, um die Anzahl der Cluster im Bereich der Point-spread-Funktion des Gerätes enthalten quantitate. Diese Kalibrierung muß mit den gleichen optischen Bedingungen während der Bildanalyse Korrelation Spektroskopie verwendet durchgeführt werden.

Protocol

(1) Aussaat von adhärenten Zelllinien für Imaging-Experiment Seed 10.000 A431 epidermoid Karzinomzellen pro gut über Nacht (O/N) in 300 µL Dulbeccos Eagle Medium/Nährstoff-Mischung geändert f-12 (DMEM/F-12) Medien mit 10 % fötalen Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin 1 % GlutaMAX in 8 Kammern imaging Folie für hochauflösende Öl eintauchen-Objektive geeignet (z.B., NuncTM Labor-TekTM Kammern Deckglas). Rezeptor-Aggregation auf A431 Zellen mit Zusatz von 100 ng/mL EGF Liganden …

Representative Results

Eine erfolgreiches Image Korrelation Spektroskopie Experiment ist die ordnungsgemäße Anwendung der Behandlung Steuerelemente abhängig. Diese Behandlungsgruppen umfassen die Prüfung der Fluoreszenz in keine primären Antikörper und keine Sekundärantikörper Behandlungsgruppen. Sobald die optimale konfokale Lasereinstellungen für ein Experiment hergestellt sind, müssen Bilder von diesen Kontrollgruppen zu bestätigen, das Fehlen von unspezifischen Fluoreszenz in der Probe erfasst we…

Discussion

Die Technik des Bildes Korrelation Spektroskopie (ICS), die wir in diesem Protokoll zu beschreiben verwendet standard konfokale Mikroskope ohne die Notwendigkeit für spezielle Detektoren. Die beschriebene ICS-Technik nutzt etablierte Immunocytochemistry Methoden für schnelle Probenahme von mehreren Behandlungsbedingungen für erhöhte statistische Analysen zu. Diese Methodik tut dies mit einem leichten Rückgang der absoluten Präzision im Vergleich zu alternativen Einzelmolekül-Techniken basierend auf Korrelation der…

Materials

Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass – 8 well	ThermoFisher Scientific	155409
DPBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	14190144
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	10099141
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	ThermoFisher Scientific	12604021
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A11013
TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µm	ThermoFisher Scientific	T7279
Cetuximab	Merck Serono	3023715501
Parafilm M 38mx100mm	Merck Millipore	BRND701605
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	ProSciTech	C004
Recombinant Human EGF	R&D System	236-EG