פיתוח Microfluidic ללמוד את היכולת התארכות של תאי צמחים הגדלים עצה בחללים קטנים מאוד
Summary
אנו מתארים שיטה כדי לחקור את היכולת של עצה גידול תאי צמחים, כולל אבקה צינורות, שערות השורש, וטחב protonemata, להאריך להידחק למרווחים צרים מאוד (~ 1 מיקרומטר) במכשיר microfluidic.
Abstract
In vivo, תאי צמחים הגדלים טיפ צריך להתגבר על סדרה של מכשולים פיזיים; עם זאת, החוקרים חוסר המתודולוגיה להמחיש התנהגות הסלולר בתנאים מגבילים כאלה. כדי לטפל בבעיה זו, פותחו תאי צמיחה עבור עצה גידול הצמח תאים המכילים סדרה של פערים צר, מפוברק-מיקרו (~ 1 מיקרומטר) במצע פולי-dimethylsiloxane (PDMS). חומר שקוף זה מאפשר למשתמש לעקוב אחר עצה התארכות התהליכים תאים בודדים בזמן החדירה microgap על ידי הדמיה בצילום מואץ. באמצעות פלטפורמה ניסיוני זו, נצפו שינויים מורפולוגיים אבקה צינורות כפי שהם חדרו את microgap. אנחנו נתפס השינויים הדינמיים בצורה של גרעין וגטטיבי fluorescently שכותרתו ותאי הזרע צינור אבקה בתהליך זה. יתר על כן, אנו הפגינו את היכולת של שערות השורש, מוס protonemata לחדור הפער 1 מיקרומטר. פלטפורמה זו במבחנה ניתן ללמוד תאים מסוימים, להגיב מקומות מוגבל פיזית, עשוי לספק תובנות לגבי מנגנוני עצה-צמיחה.
Introduction
לאחר גרגרי אבקה לנבוט על סטיגמה, כל גרגיר מייצרת צינור אבקה יחיד שנושאת תאי זרע לתא הביצה, התא המרכזי להפרייה לדישון כפול. אבקה צינורות להאריך באמצעות הסגנון ולהגיע בסופו של דבר ביצית על ידי חישה רמזים הדרכה מרובים לאורך הדרך שלהם1. במהלך התארכות, אבקה צינורות נתקל סדרה של מכשולים פיזיים; המסלול שידור מלא תאים, אבקה צינורות עליך להזין הפתח micropylar דקה של ביצית להגיע שלהם היעד (איור 1 א’)2. לכן, אבקה צינורות צריכה להיות יכולת לחדור מכשולים פיזיים, תוך כדי לנקוט הלחץ compressive של סביבתם. שערות השורש הינם סוג נוסף של גידול עצה תא צמח זה חייבים לעמוד חסימות בסביבת, בצורה של חלקיקי הקרקע ארוז (איור 1B).
תכונות מכאניות שונות הנביטה נחקרו, כולל לחץ טורגור הנוקשות של אזור הפסגה של התא, אשר ניתן למדוד באמצעות מיקרוסקופ כוח הסלולר פלסמוליזה התחלתית שיטה3,4 (CFM) 5 , 6, בהתאמה. עם זאת, שיטות אלה לבד אינם מגלים אם צינורות אבקה מסוגלים מתארך דרך מחסומים פיזיים לאורך נתיבים הצמיחה שלהם. טכניקה חלופית המאפשר התארכות הנביטה בפיקוח ויוו היא מיקרוסקופ שני הפוטונים7. עם זאת, בשיטה זו, קשה לצפות את שינויים מורפולוגיים צינורות בודדים אבקה עמוק בתוך הרקמה ביצית. בנוסף, צמיחת השיער שורש בקרקע, ניתן לאבחן באמצעות טומוגרפיה הממחושבת טומוגרפיה ממוחשבת (CT) ודימות תהודה מגנטית (MRI)8, אמנם עם רזולוציה נמוכה. כאן, אנו מציגים שיטה שבה ניתן להשתמש כדי לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה של תהליך דפורמציה של התא במיקרוסקופ רגיל.
המטרה הכוללת של השיטה המתוארת כאן היא להמחיש את היכולת התארכות של עצה גידול תאי צמחים, כולל אבקה צינורות, שערות השורש, מוס protonemata, בחללים קטנים מאוד. כמו microdevices פולי-dimethylsiloxane (PDMS) הציג כתב יד זה שקופים שטיחות והאוויר חדיר, אנחנו יכולים התרבות תאים חיים בתוך המכשיר ובדוק אם צוינו והתנהגותם צמיחה תחת מיקרוסקופ. אפשרי גם ליצירת מיקרו ~ ננומטר רווחים בקנה מידה על ידי טכניקת הדפס אבן רכה9 עם השימוש בתבניות. תכונות אלה מאפשרות לנו ללמוד את היכולת התארכות של תאי צמחים הגדלים עצה בסביבה מוגבלת פיזית.
בעבודה זו, אנו נבנה 1 מיקרומטר רחב פערים (4 מיקרומטר בגובה) במכשירים microfluidic, בחן את היכולת של אבקה צינורות לחדור מכשולים מלאכותיים אלה, כי הם הרבה יותר קטן מאשר הקוטר של הצינור אבקה גלילי (כ 8 מיקרומטר). פלטפורמה ניסיוני זו מאפשרת לנו לדמיין של הנביטה בתגובה microgaps, ללכוד תמונות בצילום מואץ של התגובה, אשר לעקוב אחר תהליך דפורמציה של התא. פיתחנו גם את microdevices יכול לשמש כדי לחקור את יכולת החדירה של שערות השורש, מוס protonemata. מספר microdevices דווחו עד היום המאפשרים את החזיית שורש10,11,12,13 ו מוס protonemata14 צימוח ברזולוציה גבוהה. במכשיר שלנו, סדרה של שורש השיער הצמיחה ערוצי מחוברות בניצב לתא צמיחה שורש, שורש בודדים שערות (כ 7 מיקרומטר בקוטר) מודרכים ערוצי fluidic עם פער רחב 1 מיקרומטר. אנחנו גם תרבותי מוס protonemata (כ 20 מיקרומטר בקוטר) ב- microdevice המכיל microgaps לבחון את התגובות שלהם את המחסומים הפיזיים. הגישה המוצעת מבוססת-microfluidic מאפשר לנו לבחון את היכולת של תאי צמחים שונים הגדלים עצה להאריך דרך חללים קטנים מאוד, אשר לא יכול להיבדק על ידי כל שיטה אחרת זמין כרגע.
Protocol
Representative Results
Discussion
מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול צריך להיות מלווה בדיוק כדי להשיג את התוצאות שהוצגו לעיל. ראשית, PDMS שכבת זכוכית התחתון מאכל משטחים שניהם להתייחס עם פלזמה עבור כמות מספקת של זמן לפני מליטה. אחרת, השכבה PDMS עשוי באופן מקומי ניתוק ממשטח הזכוכית בעוד תאי גידול עצה חוצה את microgaps. עוד צעד קריטי בפרוטו?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Tsutsui ה ו Kurihara ד שסיפקו הצמחים הטרנסגניים, כולל קו ט fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato וקו א לבנה מק’לאבר-UBQ10pro::H2B , בהתאמה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון של טרנספורמטיבי ביו-מולקולות של אוניברסיטת נאגויה, יפן מתקדמת צמח מדע ברשת. תמיכה כספית עבור עבודה זו העניקה מלגות יפן המדע, הטכנולוגיה סוכנות (ERATO הפרוייקט הענק לא. JPMJER1004 עבור תוצרת הארץ), מענק הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (Nos. JP16H06465 ו JP16H06464 עבור תוצרת הארץ), וחברה ביפן עבור Grants-in-Aid של קידום המדע (JSPS) לצורך מחקר גישוש מאתגר (גרנט 26600061 מס עבור N.Y. וגרנט ‘ קט ‘ 25650075 ו- 15 K 14542 עבור Y.S.).
Materials
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| Murashige & Skoog Medium | Wako Pure Chemical | 392-00591 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical | 196-00015 | |
| 50 mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D210402 | |
| 35 mm glass-bottom dish | Iwaki | 3971-035 | |
| Surgical blade | Feather | No.11 | |
| biopsy punches | Harris | Uni-Core | |
| Gel loading tips | Bio-Bik | 124-R-204 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX83 | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | No Catalog number is avairable for this customized microscope | |
| MetaMorph imaging software | Molecular Devices |
Referencias
- Higashiyama, T., Takeuchi, H. The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance. Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).
- Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. J., Grossniklaus, U., Obermeyer, G., Feijó, J. Measuring cytomechanical forces on growing pollen tubes. Pollen Tip Growth. , 65-85 (2017).
- Kehr, J., Wagner, C., Willmitzer, L., Fisahn, J. Effect of modified carbon allocation on turgor, osmolality, sugar and potassium content and membrane potential in the epidermis of transgenic potato (Solanum tuberosum L.) plants. J. Exp. Bot. 50 (334), 565-571 (1999).
- Benkert, R., Obermeyer, G., Bentrup, F. W. The turgor pressure of growing lily pollen tubes. Protoplasma. 198, 1-8 (1997).
- Vogler, H., et al. The pollen tube: a soft shell with a hard core. Plant J. 73 (4), 617-627 (2013).
- Shamsudhin, N., et al. Massively parallelized pollen tube guidance and mechanical measurements on a Lab-on-a-Chip platform. PloS one. 11 (12), e0168138 (2016).
- Cheung, A. Y., Boavida, L. C., Aggarwal, M., Wu, H. M., Feijó, J. A. The pollen tube journey in the pistil and imaging the in vivo process by two-photon microscopy. J Exp Bot. 61 (7), 1907-1915 (2010).
- Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: Potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11 (1), 1-11 (2015).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew Chemie Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. P Natl Acad Sci. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using the RootChip. J Vis Exp. (65), (2012).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nature Methods. 9, 1101-1106 (2012).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98, 263703 (2011).
- Bascom, C. S., Wu, S. -. Z., Nelson, K., Oakey, J., Bezanilla, M. Long-Term Growth of Moss. in Microfluidic Devices Enables Subcellular Studies in Development. Plant Physiol. 172 (1), 28-37 (2016).
- Higashiyama, T., Kuroiwa, H., Kawano, S., Kuroiwa, T. Guidance in vitro of the pollen tube to the naked embryo sac of Torenia fournieri. Plant Cell. 10, 2019-2032 (1998).
- Nishiyama, T., Hiwatashi, Y., Sakakibara, K., Kato, M., Hasebe, M. Tagged mutagenesis and gene-trap in the moss, Physcomitrella patens by shuttle mutagenesis. DNA Res. 7, 9-17 (2000).
- Maruyama, D., et al. Independent Control by Each Female Gamete Prevents the Attraction of Multiple Pollen Tubes. Dev. Cell. 25 (3), 317-323 (2013).
- Rensing, S., et al. The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants. Science. 319, 64-69 (2008).
- Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Arata, H., Higashiyama, T., Sato, Y. Capability of tip-growing plant cells to penetrate into extremely narrow gaps. Sci. Rep. 7 (1), 1403 (2017).
- Dolan, L., et al. Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis. Development. 120, 2465-2474 (1994).
- Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
