매우 작은 공간에 팁 성장 하는 식물 세포의 신장 기능 연구를 미세 장치 개발
Summary
팁 성장 하는 식물 세포, 꽃가루 관, 루트 머리, 등의 기능을 조사 하 고 미세 장치에서 protonemata, 매우 좁은 간격 (~ 1 μ m)을 통해 길게 하기 이끼 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
Vivo에서, 팁 성장 하는 식물 세포의 물리적 장벽; 시리즈를 극복 하기 위해 필요한 그러나, 연구 방법론 등 제한적인 조건에서 세포 행동을 시각화에 부족 합니다. 이 문제를 해결 하려면 폴 리-dimethylsiloxane (PDMS) 기판에 성장 챔버 팁 성장 식물, 마이크로 조작 좁은 간격 (~ 1 μ m)의 시리즈를 포함 하는 셀에 대 한 개발 했습니다. 이 투명 한 소재를 사용 하면 시간 경과 영상에 의해 microgap 침투 하는 동안 개별 셀에 팁 신장 프로세스를 모니터링할 수 있습니다. 그들은 관통는 microgap 꽃가루 관의 형태학 변화 관찰이 실험 플랫폼을 사용 하 여 합니다. 우리이 과정 붙일 레이블된 식물 핵의 모양에 동적 변화와 꽃가루 관에서 정자 세포를 점령. 또한, 우리 1 µ m 간격 침투 루트 머리카락과 모스 protonemata의 기능을 시연 했다. 이 체 외에 플랫폼은 물리적으로 제한 된 공간에 개별 세포 응답을 공부 하는 데 사용할 수 있습니다 하 고 팁 성장 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
Introduction
낙인에 꽃가루 곡물 발 아, 후 각 곡물 계란 세포 및 중앙 셀 더블 수정에 대 한 난에 정자 세포를 운반 단일 꽃가루 관을 생성 합니다. 꽃가루 관 스타일을 통해 연장 하 고 결국은 난을 도달 하는 그들의 방법1에 따라 여러 지도 신호를 감지 하 여. 신장, 동안 꽃가루 관 발생 하는 일련의 물리적 장벽; 전송 추적 셀, 채워집니다 그리고 꽃가루 관 그들의 대상 (그림 1A)2도달 하 난의 분 micropylar 개통을 입력 해야 합니다. 따라서, 꽃가루 관은 그들의 주위에서 압축 스트레스를 견 뎌 하는 동안 물리적 장애물을 관통할 수가 있어야 합니다. 루트 머리 포장된 토양 입자 (그림 1B)의 형태로 환경에서 물리적 장애물을 견딜 해야 합니다 팁 성장 하는 식물 세포의 또 다른 유형입니다.
꽃가루 관의 다양 한 기계적 특성 연구, turgor 압력 및 영역의 셀의 꼭대기, 초기 plasmolysis3,방법4 와 셀룰러 힘 현미경 검사 법을 사용 하 여 측정 될 수 있는 강성을 포함 한 (CFM) 5 , 6, 각각. 그러나, 이러한 방법은 혼자 꽃가루 관 성장 경로 따라 물리적 장벽을 통해 elongating 수 인지 공개 하지 않습니다. 모니터링 vivo에서 꽃가루 관 신장 수는 대체 기법 두 광자 현미경7이다. 그러나,이 방법으로, 그것은 개별 꽃가루 관의 형태학 적 변화를 관찰 하기 어려운 난 조직 깊숙한. 또한, 루트 머리 성장 토양에서 수 수 시각 계산 x 선 단층 촬영 (CT) 및 자기 공명 영상 (MRI)8를 사용 하 여 낮은 해상도와. 여기, 우리는 기존의 현미경에는 셀의 변형 과정의 고해상도 이미지를 사용할 수 있는 방법 제시.
여기에 설명 된 방법의 전반적인 목표는 꽃가루 관, 루트 머리를 포함 하 여 팁 성장 하는 식물 세포의 신장 기능을 시각화 하 고 protonemata 매우 작은 공간에서 이끼입니다. 폴 리-dimethylsiloxane (PDMS) 렌이이 원고에 광학 투명 하 고 공기 침투성, 우리 수 장치 내부에 살아있는 세포를 문화 고 현미경 아래에서 그들의 성장 행동 관찰. 그것은 또한 마이크로 만들 수 ~ 금형의 사용과 소프트 리소 그래피 기술9 나노미터 스케일 공간. 이러한 기능은 물리적으로 밀폐 된 환경에 팁 성장 하는 식물 세포의 신장 기능을 공부 수 있습니다.
이 작품에서는, 우리는 미세 장치에 1 µ m 넓은 간격 (높이 4 µ m)를 건설 하 고 원통형 꽃가루 관 (약 8 µ m)의 직경 보다 훨씬 작은 이러한 인공 장애물을 관통 하는 꽃가루 관의 기능을 검사. 이 실험 플랫폼 microgaps 꽃가루 관의 응답을 시각화 하 고 셀의 변형 과정을 추적 하 고 응답의 시간 경과 이미지를 캡처 수 있습니다. 우리는 또한 렌 루트 머리카락과 모스 protonemata의 침투 능력을 조사 하는 데 사용할 수 있는 개발. 여러 렌 공장 루트10,11,12,13 모스 protonemata14 성장과 높은 해상도에서 시각화를 가능 하 게 날짜에 보고 되었습니다. 우리의 장치에 루트 머리 성장 채널 시리즈 루트 성장 챔버에 수직으로 연결 하 고 개별 루트 머리 (직경에서 약 7 µ m)는 1 µ m 넓은 간격으로 유체 채널 가이드. 우리는 또한 이끼를 경작이 물리적 장벽에 대 한 그들의 응답을 검사 하는 microgaps를 포함 하는 microdevice에서 protonemata (직경에서 약 20 µ m). 제안 된 미세 기반 접근 방식을 다른 현재 사용할 수 있는 방법으로 시험 될 수 있는 매우 작은 공간을 통해 연장 하는 다양 한 팁 성장 하는 식물 세포의 기능을 탐구 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계 위의 결과 얻기 위해 정확 하 게 지켜질 필요가 있다. 첫째, PDMS 층 및 유리 하단 접시 표면 둘 다 대우 되어야 한다 플라즈마로 충분 한 양의 결합 하기 전에 시간에 대 한. 그렇지 않으면, 팁 성장 세포는 microgaps를 건너는 동안 PDMS 층 유리 표면에서 분리 로컬 수 있습니다. 루트 머리와 모스 protonemata 프로토콜에서 다른 중요 한 단계는 microdevice의 살 균입니다. 일반…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 감사 헤 쓰쓰이 D. 구리 유전자 변형 식물, 포함 T. fournieriRPS5Ap::H2B tdTomato 선, A. thaliana UBQ10pro::H2B mClover 선 각각 제공. 이 작품에 의해 연구소의 Transformative 바이오-의 분자 나고야 대학과 일본 고급 식물 과학 네트워크를 지원 했다. 이 작품에 대 한 재정 지원 일본 과학과 기술 기관에서 교부 금에 의해 제공 되었다 (ERATO 프로젝트 부여 없음. 남에 대 한 JPMJER1004), 선진적인 과학 연구에 대 한 혁신적인 지역 (번호. JP16H06465 고 남에 대 한 JP16H06464), 그리고 도전적인 탐구 연구 (no. 26600061에 대 한 부여 뉴욕 및 그랜트 no. 25650075와 15 K 14542와이 스에 대 한)에 대 한 과학 진흥 (JSP) 연구비를 위한 일본 사회.
Materials
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| Murashige & Skoog Medium | Wako Pure Chemical | 392-00591 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical | 196-00015 | |
| 50 mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D210402 | |
| 35 mm glass-bottom dish | Iwaki | 3971-035 | |
| Surgical blade | Feather | No.11 | |
| biopsy punches | Harris | Uni-Core | |
| Gel loading tips | Bio-Bik | 124-R-204 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX83 | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | No Catalog number is avairable for this customized microscope | |
| MetaMorph imaging software | Molecular Devices |
Referencias
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