用两个稳定 Isotopically 标记鞘磷脂种鞘磷脂的定量和定性方法
Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以量化和合格的每个鞘磷脂物种使用多反应监测和 ms/毫秒/ms 模式, 分别。
Abstract
本文提出了用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱 (LC-鞘磷脂) 定性和定量分析 (SM) 的方法。SM 是由氯化磷和神经酰胺组成的一种常见鞘脂, 分别为亲水性和疏水性成分。由于 sphingoid 长链基 (LCB) 和神经酰胺中的一个N酰基团的变化, 许多 SM 物种存在于哺乳动物细胞中。在本报告中, 我们展示了一种估算 LCB 中碳和双键的数量和一个基于其相应的产品离子的N-酰基基团 (ms3) 实验的方法。此外, 我们提出了一个定量的分析方法的 sm 使用两个稳定的 isotopically 标记 sm 物种, 这有助于确定的范围内使用的 sm 定量。本方法将有助于在生物样品和化妆品等工业产品中表征各种 SM 品种。
Introduction
鞘磷脂 (SM) 是哺乳动物细胞中常见的鞘脂。SM 是合成 intracellularly1和目前作为其他鞘脂类的前兆, 如 sphingosine-1-phosphate 和神经酰胺, 这在免疫细胞贩运和皮肤屏障稳态的关键作用, 分别为2, 3。因此, 对 SM 代谢的精确分析对于阐明鞘脂类的生理和病理作用具有重要意义。
SM 由神经酰胺和氯化磷组成, 它与神经酰胺的 1-羟基基团相连, 它由一个鞘和一个N-酰基团组成。鞘和N-酰基基团中的碳和双键数的变化导致神经酰胺 (和 SM) 种类的数量。LC-ESI/ms 的最新进展使 SM4、5的数量和质量分析得以实现。在定性分析中, 通过分配 LCB 的产品离子谱, 确定了 SM sphingoid LCB 的碳和双键的数量。但是, 由于未报告相应的产品离子, 所以未直接获得n-酰基基团的结构信息, 因此, 通过对前驱离子之间的微分分析, 导出了n酰基团, 并在正负离子模式下与 LCB 对应的产品离子4,5。在本报告中, 我们提出了一种用三重四极和四极线性离子阱质谱法在 MS3模式中同时检测 LCB 和N酰基团的产物离子的方法, 这有助于精确的结构对每个 SM 物种的推测6。
基质在生物样品中所引起的离子抑制 (或增强) 效应阻碍了 LC-ESI-质谱分析中的精确量化, 因此, 在相同矩阵中, 为所有感兴趣的解析度构造校正曲线是可取的。的生物样本。然而, 这一策略是不可行的, 因为几乎不可能准备所有 SM 物种的生物样本, 特别是在综合分析。因此, 在生物样品中, 采用有代表性的 SM 种来构造标定曲线, 确定定量范围是切实可行的。我们用两个 isotopically 标记的 SM 种来构造一个定标曲线;一个用于内部标准, 另一个用于标准化合物。我们检测出少量的 isotopically 标记的 SM 品种作为标准化合物在生物样品中被刺, 并且成功地获得了校正曲线和定量范围6。
Protocol
Representative Results
Discussion
在目前的定性方法中, 我们获得了 SPC 的3产品离子和一个N-酰基团。正确分配 SPC 和N-酰基基团是至关重要的。为此, 应该指出的是, 其他含有氯化磷的分子也可以被检测为 MS3产品离子。Diacyl 磷脂酰胆碱 (pc) 和缩醛磷脂-pc 在哺乳动物细胞中大量存在, 其疏水性与 SM 相似。因此, diacyl-pc 和缩醛磷脂-与同位素 (通常为13 C) 的 pc 可以在理论上与 SM 同时检测。在实验?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了日本教育、文化、体育、科学和技术部 (KAKENHI) 对 K.H. (#15K01691)、许贤 (#15K08625)、肯塔基州 (#26461532) 的研究补助金的支助, 并获得了教育部关于顽固性疾病项目的研究补助金。健康、劳动和福利 (肯塔基州 #201510032A)。我们感谢 Edanz 集团 (www.edanzediting.com/ac) 编辑这份手稿的草稿。
Materials
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
| Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
| Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
| Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
| Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
| CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
| CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
| Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
| Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
| 2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
| Methanol | Wako | 134-14523 | |
| Formic acid | Wako | 066-00466 | |
| 28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
| Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
| Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
| 1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
| 8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
| Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
| Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
| PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
| The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
| The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
| HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
| Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
| d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
| Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |
Referencias
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