LC-MS Isotopically 두 안정을 사용 하 여 Sphingomyelin에 대 한 양적 및 질적 방법 Sphingomyelin 종 분류
Summary
여기, 우리가 현재 계량 하 여 여러 반응 모니터링을 사용 하 여 각 sphingomyelin 종 자격 프로토콜 및 MS/MS/MS 모드, 각각.
Abstract
우리는 방법 sphingomyelin (SM) 질적 분석의 양적 액체 착 색 인쇄기-분무 이온화 탠덤 질량 분석 (LC-ESI-MS/MS)에 의해 제시. SM은 일반적인 sphingolipid는 phosphorylcholine와는 세 라마 이드의 친수성 및 소수 성 구성 요소로 각각 구성. SM 종 수 sphingoid 긴 체인 베이스 (LCB) 다양 한 때문에 포유류 세포에 존재 하는 N-acyl moiety는 세 라마 이드에. 이 보고서에서는 탄소와는 LCB와 N이중 결합의 수를 추정 하는 방법을 보여 줍니다-acyl moiety MS/MS/MS (MS3) 실험에서 그들의 해당 제품 이온에 따라. 또한, 우리는 현재 정량 분석 방법 에스엠에 대 한 종을 사용 하 여 두 개의 안정적인 isotopically 레이블 SM, SM 정량에 사용 되는 범위를 결정을 용이 하 게 하. 현재 메서드는 SM 종 생물 학적 샘플 및 화장품 등 산업 제품의 다양 한 특성화에 유용할 것 이다.
Introduction
Sphingomyelin (SM)은 포유류 세포에 있는 일반적인 sphingolipid. SM은 합성 침1 와 다른 sphingolipids에 대 한 선구자로 서 현재와 같은 면역에 중요 한 역할을가지고 있는 sphingosine 1 인산 염 및 세 라마 이드, 밀매 셀 피부 장벽 항상성, 각각2, 3. 따라서, SM 대사의 정확한 분석 elucidating sphingolipids의 생리 및 병 적인 역할에 대 한 중요 하다.
SM는 세 라마 이드와는 sphingosine와 N의 추가 구성 되는 세 라마 이드의 1 hydroxy 그룹에 연결 되는 phosphorylcholine의 구성-acyl moiety. Sphingosine N에 탄소와 이중 결합의 숫자에 다양 한-acyl moiety 세 라마 이드 (SM)의 수 종에서 결과. LC-ESI-MS/MS의 최근 발전은 SM4,5의 양적 및 질적 분석을 활성화 하 고. 질적 분석, 탄소 수와 sphingoid LCB의 SM의 이중 결합 LCB의 제품 이온 스펙트럼을 할당 하 여 확인 되었습니다. 그러나, N의 구조 정보-acyl moiety는 직접 얻지 못하면는 해당 제품 이온 보고 하지 않은, 때문에 그리고 그러므로 N-acyl moieties 선구자 이온 사이 차동 분석 추론 했다 고 제품 이온 모두 긍정적이 고 부정적인 이온 모드4,5에 LCB에 해당. 이 보고서에서는 LCB와 N의 제품 이온을 검출 하는 방법 소개-acyl moiety 트리플 4 중 극 4 중 극 선형 이온 함정 질량 분석, 정확한 구조를 용이 하 게 하를 사용 하 여 MS3 모드에서 동시에 각 SM 종6의 추측
생물 학적 샘플 매트릭스로 인 한 이온 억제 (또는 강화) 효과 방해 LC-ESI-MS 분석, 정확한 정량화 하 고 따라서, 그것은 동일한 매트릭스에 대 한 관심의 모든 analytes에 대 한 교정 곡선을 생성 하는 것이 좋습니다. 생물 학적 샘플. 그러나,이 전략은 불가능 하기 때문에 그것은 거의 모든 SM 종 종합 분석에 특히 생물학 견본에서 준비 가능 하지. 따라서, 보정 곡선을 건설 하 고 대표적인 SM 종 생물 학적 샘플에서 아군을 사용 하 여 양적 범위를 결정 하는. 우리는 보정 곡선; 구성 두 isotopically 표시 된 SM 종 사용 하나는 내부 표준 및 표준 화합물에 대 한 다른 사용 되었다. 우리는 생물 학적 샘플에 아군 하 고 성공적으로 교정 곡선과 양적 범위6표준 화합물으로 SM 종 isotopically 표시의 작은 금액을 감지.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 질적 방법에서 우리가 MS3 는 SPC와 N의 제품 이온을 얻은-acyl moiety. 제대로 SPC와 N을 할당 하는 것이 중요-acyl moiety. 이 위해, 그것은 다른 phosphorylcholine 포함 된 분자 또한 MS3 제품 이온으로 검출 될 수 있습니다 주목 해야한다. Diacyl-phosphatidylcholine (PC)와 plasmalogen-PC는 포유류 세포에 풍부 하 게 존재 이며 그들의 hydrophobicity SM 비슷합니다. 따라서, diacyl-PC와 동위 원소…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품에서 교육 과학기술부, 문화, 스포츠, 과학 및 기술의 일본 (KAKENHI) 경호 (#15 K 01691)를, Y.F. (#15 K 08625), 부장 (#26461532), 및의 사역에서 다루기 힘든 질병 프로젝트의 연구에 대 한 부여 연구 보조금에 의해 지원 되었다 건강, 노동 및 복지 (부장 #201510032A) 우리는이 원고 초안을 편집 하기 위해 Edanz 그룹 (www.edanzediting.com/ac) 감사 합니다.
Materials
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
| Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
| Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
| Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
| Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
| CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
| CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
| Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
| Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
| 2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
| Methanol | Wako | 134-14523 | |
| Formic acid | Wako | 066-00466 | |
| 28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
| Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
| Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
| 1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
| 8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
| Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
| Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
| PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
| The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
| The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
| HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
| Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
| d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
| Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |
Referencias
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