Método cuantitativo y cualitativo de la esfingomielina por LC-MS con dos estable isotópicamente etiquetada especies de esfingomielina
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar y calificar cada especie de esfingomielina mediante monitoreo de reacción múltiple y modo MS/MS/MS, respectivamente.
Abstract
Se presenta un método de analizar la esfingomielina (SM) cualitativamente y cuantitativamente por cromatografía líquido-electrospray ionización-tandem espectrometría de masas (LC-ESI-MS/MS). SM es un sphingolipid común compuesto por una Fosforilcolina y una ceramida como la componente hidrofílico e hidrofóbico, respectivamente. Un número de especies de SM está presente en células de mamífero debido a una variedad en el esfingoide larga cadena base (LCB) y un N-molécula de acil en la ceramida. En este informe, se muestra un método para estimar la cantidad de carbono y de dobles enlaces en un LCB y un N-molécula de acil basado en sus correspondientes iones producto de experimentos de MS/MS/MS (MS3). Además, se presenta un método de análisis cuantitativo de SM utilizando dos estable isotópicamente etiquetada SM especies, lo que facilita determinar el rango utilizado en la cuantificación de SM. El presente método será útil en la caracterización de una variedad de especies de SM en muestras biológicas y productos industriales tales como cosméticos.
Introduction
Esfingomielina (SM) es un sphingolipid comun en células de mamíferos. SM es sintetizada intracelularmente1 y presente como un precursor para otros esfingolípidos como un esfingosina-1-fosfato y una ceramida, que tienen papeles cruciales en inmune celular trata y homeostasis de la barrera, respectivamente2, de la piel 3. Así, el análisis preciso del metabolismo del SM es importante dilucidar las funciones fisiológicas y patológicas de los ESFINGOLIPIDOS.
SM se compone de una ceramida y una Fosforilcolina vinculado con el grupo 1-hidroxilo de la ceramida, que se compone además de una esfingosina y un N-molécula de acil. Una variedad en los números de carbono y doble enlace en la esfingosina y la N-molécula de acil da lugar a la especie número de ceramida (y SM). Los avances recientes en LC-ESI-MS/MS ha permitido análisis cuantitativo y cualitativo de la SM4,5. En el análisis cualitativo, el número de carbono y de dobles enlaces de un esfingoide LCB de SM fue identificadas mediante la asignación de espectros de iones producto de LCB. Sin embargo, la información estructural de la N-molécula de acil directamente no se obtuvo porque no se han divulgado sus correspondientes iones producto y por lo tanto N-grupos acilo se dedujeron por análisis diferencial entre los iones precursores y iones del producto correspondiente a LCB en ambos iones positivos y negativos modos4,5. En este informe, presentamos un método para detectar los iones producto de LCB y N-molécula de acil simultáneamente en MS3 modo de triple cuadrupolo y espectrometría de masas de trampa iónica lineal cuadrupolo, que facilita la precisión estructural especulación de cada especie de SM6.
Los efectos de la supresión (o mejora) de ion causados por la matriz en muestras biológicas dificultan la exacta cuantificación en el análisis por LC-ESI-MS, y por lo tanto, es deseable para construir curvas de calibración para todos los analitos de interés en la matriz idéntica de la muestra biológica. Sin embargo, esta estrategia no es factible porque es casi imposible preparar todas las especies de SM en muestras biológicas, especialmente en análisis completo. Por lo tanto, es práctico construir una curva de calibración y determinar el rango cuantitativo mediante una especie de SM representante de tacon en las muestras biológicas. Utilizamos dos especies de SM isotópicamente etiquetados para la construcción de una curva de calibración; uno fue utilizado para el estándar interno y el otro de un compuesto estándar. Se detectó una pequeña cantidad de especie SM isotópicamente etiquetada como un compuesto estándar tacon en muestras biológicas y obtuvo con éxito una curva de calibración y la gama cuantitativa6.
Protocol
Representative Results
Discussion
En el presente método cualitativo, hemos obtenido MS3 iones del producto de un proceso estadístico y un N-molécula de acil. Es fundamental para asignar correctamente un SPC y una N-molécula de acil. Para ello, debe señalarse que también se pueden detectar otras moléculas de Fosforilcolina que contiene como MS3 iones del producto. Diacil-fosfatidilcolina (PC) y del plasmalógeno del PC están abundantemente presentes en células de mamífero y su hidrofobicidad es similar a l…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por una beca de investigación del Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología de Japón (KAKENHI) a K.H. (#15 K 01691), Dufr (#15 K 08625), K.Y. (#26461532) y una beca para el estudio de la enfermedad del Ministerio de Salud, trabajo y bienestar (K.Y. 201510032A #). Agradecemos la Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) para la edición de una versión preliminar de este manuscrito.
Materials
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
| Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
| Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
| Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
| Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
| CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
| CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
| Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
| Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
| 2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
| Methanol | Wako | 134-14523 | |
| Formic acid | Wako | 066-00466 | |
| 28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
| Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
| Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
| 1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
| 8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
| Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
| Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
| PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
| The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
| The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
| HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
| Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
| d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
| Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |
Referencias
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