ייצור הטרנסגניים צמחים עם הוספות עותק יחיד באמצעות וקטור בינארי BIBAC-ג'י
Summary
באמצעות pBIBAC-GW וקטור בינארי הופך ייצור הטרנסגניים צמחים עם הוספות עותק יחיד ללא פגע, תהליך קל ופשוט. . הנה, סדרה של פרוטוקולים מוצג מדריך את הקורא לאורך התהליך הטרנסגניים תודרנית מפעלים לייצור, ובדיקות את הצמחים על intactness, להעתיק מספר התוספות.
Abstract
בעת יצירת הצמחים הטרנסגניים, בדרך כלל המטרה היא שיהיה יציב לביטוי transgene. פעולה זו דורשת שילוב יחיד, שלם של transgene, גם מרובת עותקים שילובים נחשפים לעיתים קרובות ג’ין להחרשת. הווקטור שער תואמת בינארית המבוסס על חיידקי מלאכותי כרומוזומים (pBIBAC-GW), כמו אחרים נגזרים pBIBAC, מאפשר החדרת transgenes עותק יחיד עם יעילות גבוהה. כמו שיפור pBIBAC המקורי, קלטת שער נשלטה לתוך pBIBAC-ג’י, כך הרצפים של עניין ניתן עכשיו בקלות לשלב ההעברה וקטור DNA (T-DNA) על-ידי שיבוט שער. בדרך כלל, השינוי עם pBIBAC-GW תוצאות יעילות של 0.2-0.5%, לפיה מחצית transgenics נושא שילוב יחיד-עותק שלם ב- T-dna. PBIBAC-GW הווקטורים זמינים עם עמידות Glufosinate-אמוניום או DsRed זריחה במעילים seed עבור בחירה בצמחים, ועם התנגדות kanamycin כבחירה של חיידקים. . הנה, סדרה של פרוטוקולים מוצג שמנחים את הקורא לאורך התהליך של יצירת הצמחים הטרנסגניים באמצעות pBIBAC-GW: החל משילוב מחדש את רצפי עניין לתוך וקטור pBIBAC-GW של בחירה, לשתול טרנספורמציה עם Agrobacterium, מבחר של transgenics, ובדיקות את הצמחים על מספר intactness, ולהעתיק הכיסויים באמצעות DNA סופג. תשומת לב ניתנת לתכנון אסטרטגיה blotting DNA לזהות copy יחיד מרובי שילובים-לוקוסים מרובות.
Introduction
בעת יצירת הצמחים הטרנסגניים, בדרך כלל המטרה היא לקיים את transgene(s) משולב stably הביע. זו יכולה להיות מושגת על ידי עותק בודד ללא פגע שילובים של transgene. שילובים מרובות עלולה לגרום ביטוי מוגבר transgene, אלא גם ג’ין להחרשת. וכמובן transgenes סביר יותר אם רצפים שנוספו מסודרים טנדם או הפוך חזרה1,2,3,4. וקטורים בינארי משמשים הסעות ב Agrobacterium-מתווכת טרנספורמציה ניסויים כדי לספק את רצפי עניין לתוך הגנום הצמח. מספר שילובים לתוך הגנום הצמח תלויה עותק מספר בינארי וקטור ב-5, Agrobacterium tumefaciens6. וקטורים בינאריים נפוצים רבים הן וקטורי העתק גבוהה, ולכן התשואה מספר עותק transgene ממוצע גבוה: 3.3 ל 4.9 עותקים תודרנית5.
ניתן להוריד את מספר שילובים T-DNA באמצעות וקטורים בינארי כי יש מספר נמוך-עותק tumefaciens א, כגון BIBAC7, או על-ידי שיגור T-DNA בין כרומוזום tumefaciens א 5. המספר הממוצע של שילובי transgene במקרים כאלה הוא מתחת 25,8,9,10. בשל היותם עותק יחיד ב- tumefaciens א, וגם ב- Escherichia coli, BIBAC-נגזרים יכול לתחזק ולספק בונה גדול כמו 150 kb11.
GW תואמי BIBAC וקטורים10,12 לאפשר הקדמה קלה של הגנים של עניין לתוך הווקטור באמצעות שער שיבוט. השימוש בטכנולוגיה שער מאוד מפשט את הליך השיבוט, אבל גם מתגבר על בעיות נפוצות המשויך וקטורים נמוך-העתקה-מספר גדול13,14, כגון תשואה נמוכה של DNA ומבחר מצומצם של הגבלת ייחודי אתרים זמינים עבור שכפול7,11. נגזרות pBIBAC-GW זמינים גם התנגדות Glufosinate-אמוניום (pBIBAC-בר-GW) או DsRed זריחה במעילים הזרע (pBIBAC-RFP-GW) לבחירת צמחים (איור 1)10,12. עבור שני וקטורים, גן עמידות kanamycin משמש סמן הבחירה של חיידקים.
לשלב הווקטורים pBIBAC-GW: מניפולציה גנטית ב e. coliו שילובים עותק יחיד (2) שלם ב הפיסקו יעילות גבוהה ועיצוב קל (1). PBIBAC-GW וקטורים התשואה על שילובים בממוצע 1.7 ב תודרנית כמחצית הצמחים הטרנסגניים נושא יחיד משולב T-DNA10.
ביטוי יציב של transgenes הוא דרישה עבור רוב transgenics שנוצר. Transgene יציב הביטוי יכולה להיות מושגת על ידי שילובים ללא פגע, עותק יחיד. עבודה עם הצמחים הטרנסגניים נושא שלם, עותק יחיד שילובים היא, עם זאת, חשוב אפילו יותר אם לדוגמה, המטרה היא לחקור את היעילות של תהליכים מבוססי-כרומטין, כגון מוטגנזה מכוונת, רקומבינציה, או לתקן את התלות של אלה תהליכים על המיקום גנומית ומבנה כרומטין במתחם הכניסה. על האינטרסים שלנו, ללמוד את התלות של oligonucleotide ביים מוטגנזה מכוונת (ODM) על ההקשר המקומי גנומית, קבוצה של קווים כתב עם תוספות ללא פגע, עותק יחיד של גנים כתב מוטגנזה מכוונת היה (איור 2) שנוצר10. באמצעות ערכת שורות, זה הוצג כי היעילות ODM משתנה בין לוקוסים הטרנסגניים משולב במקומות שונים גנומית, למרות רמות הביטוי transgene להיות דומה למדי.
Protocol
Representative Results
Discussion
קריטי כדי לייצר transgenics עם שילובי יחיד, שלם של transgene הוא הבחירה של וקטור בינארי המשמש. וקטורים משפחה BIBAC שימשו להעביר רצפים של תחומי עניין רבים צמח מינים23,24,25,26,27,28. וקטורים BIBAC, BIBAC-ג’י, ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי ההולנדי בטכנולוגיית קרן STW (12385), אשר הוא חלק מהארגון הולנד על מחקר מדעי (בתחרות), אשר ממומן בחלקו על ידי משרד כלכלי פרשיות (OTP גרנט 12385 ל MS). אנו מודים קרול מ המילטון (אוניברסיטת קורנל, ארה ב) על מתן pCH20, עמוד השדרה של הווקטורים BIBAC-GW.
Materials
| Kanamycin sulphate monohydrate | Duchefa | K0126 | |
| Gentamycin sulphate | Duchefa | G0124 | |
| Rifampicin | Duchefa | R0146 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T-3383 | |
| DB3.1 competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 11782-018 | One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead |
| DH10B competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 18290-015 | |
| Gateway LR clonase enzyme mix | Thermo Scientific – Invitrogen | 11791-019 | |
| tri-Sodium citrate dihydrate | Merck | 106432 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| EDTA disodium dihydrate | Duchefa | E0511 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Sodium chloride | Honeywell Fluka | 13423 | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck | 108346 | |
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap | Biorad | 1652089 | |
| Electroporator Gene Pulser | BioRad | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Calbiochem | 442613 | |
| D(+)-Maltose monohydrate 90% | Acros Organics | 32991 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Silwet L-77 | Fisher Scientific | NC0138454 | |
| Murashige Skoog medium | Duchefa | M0221 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| Glufosinate-ammonium (Basta) | Bayer | 79391781 | |
| Restriction enzymes | NEB | ||
| Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1610433 | |
| Electrophoresis system | Bio-Rad | ||
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100316 | |
| Blotting nylon membrane Hybond N+ | Sigma Aldrich | 15358 | or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B) |
| Whatman 3MM Chr blotting paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-931 | |
| dNTP | Thermo Fisher | R0181 | |
| Acetylated BSA | Sigma-Aldrich | B2518 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 805740 | |
| Sephadex G-50 Coarse | GE Healthcare Life Sciences | 17004401 | or Sephadex G-50 Medium (17004301) |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | US Biological | S5010 | |
| Salmon Sperm DNA | Sigma-Aldrich | D7656 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Storage Phosphor screen and casette | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-74 | |
| Phosphor imager | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon FLA 7000 | |
| UV Crosslinker | Stratagene | Stratalinker 1800 | |
| cling film (Saran wrap) | Omnilabo | 1090681 | |
| Agarose | Thermo Scientific – Invitrogen | 16500 | |
| Boric acid | Merck | 100165 | |
| DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. | MRC Holland | MCT8070 | |
| DNA marker ‘Rood’; DNA ladder | MRC Holland | MCT8080 | |
| Hexanucleotide Mix | Roche | 11277081001 | |
| Large-Construct Kit | Qiagen | 12462 | |
| Heat-sealable polyethylene tubing, clear | various providers | the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane | |
| Heat sealer | |||
| Membrane filter disk | Merck | VSWP02500 | |
| Magnesium chloride | Merck | 105833 | |
| Hybridization mesh | GE Healthcare Life Sciences | RPN2519 |
Referencias
- Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
- Stam, M., et al. Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats. Plant J. 12, 63-82 (1997).
- Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants. Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
- Jin, Y., Guo, H. S. Transgene-induced gene silencing in plants. Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).
- Oltmanns, H., et al. Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA]. Plant Physiol. , (2010).
- Ye, X., et al. Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Res. , (2011).
- Hamilton, C. M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA. Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).
- Vega, J. M., et al. Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors. Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).
- Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta. Plasmid. 89, 27-36 (2017).
- Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).
- Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing. PLoS Genet. 9 (10), e1003773 (2013).
- Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
- Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange. Plant Methods. 7, 33 (2011).
- Woodman, M. E., et al. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).
- Ausubel, F. M., et al. Mol Biol. Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).
- Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349 (1991).
- Clarke, J. D. Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation. Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning. , (2012).
- Sosa, J. M. Chromatography with Sephadex Gels. Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).
- Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).
- Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization. Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).
- Lee, M. K., et al. Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L). BMC Genomics. 14, 208 (2013).
- Wang, W., et al. A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes. Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).
- Wu, C., et al. A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome. Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).
- Xu, Z., et al. Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum. Nucleic Acids Res. 33 (5), e50 (2005).
- Zhang, M., et al. Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L. PLoS One. 7 (3), e33644 (2012).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato. Transgenic Res. , (2001).
- Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants. Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
- Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants. Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).
- Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants. Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).
