BIBAC-GW 이진 벡터를 사용 하 여 단일 복사본 삽입을 가진 유전자 변형 식물 생성
Summary
PBIBAC-GW 이진 벡터를 사용 하 여 생성 유전자 변형 식물을 그대로 단일 복사본 삽입, 쉬운 과정을 만든다. 여기, 프로토콜의 시리즈는 유전자 변형 애기 식물을 생성 하 고 intactness에 대 한 식물을 테스트 과정을 통해 독자를 안내 하 고 삽입의 수를 복사 하 여.
Abstract
유전자 변형 식물을 생성할 때 일반적으로 목표는 transgene의 안정적인 식 것입니다. 이 transgene의 단일, 그대로 통합 다중 복사 통합 유전자 입을 대상이 종종 필요 합니다. 다른 pBIBAC 파생 상품 같은 세균성 인공적인 염색체 (pBIBAC-GW)에 따라 게이트웨이 호환 이진 벡터 고효율 단일 카피 transgenes의 삽입을 수 있습니다. 원래 pBIBAC에 개선으로 게이트웨이 카세트는 되었습니다 복제 pBIBAC GW에 관심의 시퀀스 지금 통합 될 수 있다 쉽게 벡터 전송 DNA (T-DNA)에 게이트웨이 복제 하 여 그렇게. 일반적으로, pBIBAC GW와 변환 결과 0.2-0.5 효율 %, 그것에 의하여는 제 닉의 T-DNA의 본래 단일 복사 통합 수행. PBIBAC-GW 벡터 Glufosinate 염화에 저항 또는 선택 식물, 씨 외 투에서 DsRed 형광와 저항 대에 박테리아에서 선택 항목으로 사용할 수 있습니다. 여기, 프로토콜의 시리즈 pBIBAC GW를 사용 하 여 유전자 변형 식물 생성의 과정을 통해 독자를 안내 하는 표시 됩니다: 진상을 공장 로 변환 하는 선택의 pBIBAC GW 벡터에 관심의 시퀀스에서 시작 Agrobacterium, 제 닉, 그리고 테스트 DNA 럽을 사용 하 여 삽입의 intactness 및 복사 번호에 대 한 식물의 선택. 주의는 DNA 더 럽 히 전략을 인식 하는 단일 및 다중 loci에서 단일 및 다중 복사 통합 주어 집니다.
Introduction
유전자 변형 식물을 생성할 때 일반적으로 목적은 안정적으로 표현 하는 통합된 transgene(s) 것입니다. 이 transgene의 그대로 단일 복사본 통합 하 여 얻을 수 있습니다. 여러 통합은 transgene의 증가 표현 뿐만 아니라 유전자 입을 발생할 수 있습니다. Transgenes의 입을 경우 삽입된 시퀀스 협동 또는 거꾸로 반복1,2,,34에서 배열 된다 확률이 높다. 이진 벡터 Agrobacterium에 셔틀으로 이용 된다-식물 게놈으로 관심의 시퀀스를 제공 하는 변환 실험을 중재. 식물 게놈으로 통합의 수 Agrobacterium tumefaciens5,6. 이진 벡터의 복사본 수에 따라 달라 집니다. 많은 일반적으로 사용 되 이진 벡터는 높은 복사 벡터 및 따라서 높은 평균 transgene 복사본 수를 산출: 애기53.3 4.9 복사본.
BIBAC7또는 T-DNA A. tumefaciens 염색체5에서 시작 하 여 낮은 복사 번호 A. tumefaciens에 있는 이진 벡터를 사용 하 여 T-DNA 통합의 수를 낮출 수 있습니다. 이러한 경우 transgene 통합의 평균 수는 25,8,,910아래입니다. 따른 단일-복사 A. tumefaciens 에 대장균에서 BIBAC 파생 상품 수 유지 및 구문 150 kb11로 제공.
GW 호환 BIBAC 벡터10,12 게이트웨이 복제를 사용 하 여 벡터에 관심사의 유전자의 도입에 쉽게 수 있습니다. 게이트웨이 기술 사용 하 여 복제 프로시저를 단순화 하지만 또한 큰 낮은 복사 번호 벡터13,14, 낮은 DNA 수율 등 독특한 제한의 제한 된 선택과 관련 된 일반적인 문제를 극복 7,11복제에 사용할 수 있는 사이트. PBIBAC-GW 파생 상품 Glufosinate 염화 (pBIBAC-바-GW) 어느 저항 또는 DsRed 형광 씨 외 투 (pBIBAC-RFP-GW) 식물 (그림 1)10,12선택에 사용할 수 있습니다. 두 벡터에 대 한 대 저항 유전자는 박테리아에서 선택 마커로 사용 됩니다.
PBIBAC-GW 벡터 결합: (1) 쉬운 디자인 및 유전자 조작 대장균및 (2) 그대로 단일 복사 통합에서 planta에 높은 효율에. 들고 단일 유전자 변형 식물의 약 절반으로 애기 에 평균 1.7 통합에 pBIBAC GW 벡터 수확량은 통합 T DNA10.
안정적인 표현의 transgenes 대부분 제 닉 생성에 대 한 요구 사항입니다. 안정적인 transgene 식 그대로, 단일 복사 통합 하 여 얻을 수 있습니다. 그러나 유전자 변형 식물 그대로, 단일 복사 통합 운반 작업은,, 훨씬 더 중요 한 경우 예를 들어 목표 mutagenesis, 재결합, 또는 복구, 등 이러한 의존 chromatin 기반 프로세스의 효율성을 연구 하는 것입니다 genomic 위치 및 삽입 사이트에서 chromatin 구조에 처리 합니다. 우리의 관심 지역의 게놈 문맥에 의존 oligonucleotide 감독 mutagenesis (ODM)의 공부 mutagenesis 취재 원 유전자의 손상, 단일 복사 통합 기자 라인의 집합 생성된 (그림 2)10이었다. 이 일련의 줄을 사용 하 여, 보였다 ODM 효율 되 고 오히려 유사한 transgene 식 수준에도 불구 하 고 다른 genomic 위치의 통합 유전자 변형 loci 사이 변화 한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
생성에 중요 한 제 닉은 transgene의 단일, 그대로 통합으로 사용 되는 이진 벡터의 선택입니다. BIBAC 가족 벡터 많은 식물 종23,,2425,26,,2728관심사의 순서를 전달 하기 위해 사용 되었습니다. BIBAC 벡터, BIBAC-GW를 포함 하 여 높은 효율으로 단일 복사 통합…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 네덜란드 기술 재단 STW (12385), 네덜란드 조직에 대 한 과학적 연구 (NWO)의 부분 이다 고는 부분적으로 경제 통상 부 (OTP 부여 12385 ms)에 의해 자금이 지원 됩니다. 우리는 pCH20, BIBAC-GW 벡터의 등뼈를 제공 하기 위한 캐롤 M. 해밀턴 (코넬 대학, 미국) 감사 합니다.
Materials
| Kanamycin sulphate monohydrate | Duchefa | K0126 | |
| Gentamycin sulphate | Duchefa | G0124 | |
| Rifampicin | Duchefa | R0146 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T-3383 | |
| DB3.1 competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 11782-018 | One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead |
| DH10B competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 18290-015 | |
| Gateway LR clonase enzyme mix | Thermo Scientific – Invitrogen | 11791-019 | |
| tri-Sodium citrate dihydrate | Merck | 106432 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| EDTA disodium dihydrate | Duchefa | E0511 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Sodium chloride | Honeywell Fluka | 13423 | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck | 108346 | |
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap | Biorad | 1652089 | |
| Electroporator Gene Pulser | BioRad | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Calbiochem | 442613 | |
| D(+)-Maltose monohydrate 90% | Acros Organics | 32991 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Silwet L-77 | Fisher Scientific | NC0138454 | |
| Murashige Skoog medium | Duchefa | M0221 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| Glufosinate-ammonium (Basta) | Bayer | 79391781 | |
| Restriction enzymes | NEB | ||
| Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1610433 | |
| Electrophoresis system | Bio-Rad | ||
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100316 | |
| Blotting nylon membrane Hybond N+ | Sigma Aldrich | 15358 | or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B) |
| Whatman 3MM Chr blotting paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-931 | |
| dNTP | Thermo Fisher | R0181 | |
| Acetylated BSA | Sigma-Aldrich | B2518 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 805740 | |
| Sephadex G-50 Coarse | GE Healthcare Life Sciences | 17004401 | or Sephadex G-50 Medium (17004301) |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | US Biological | S5010 | |
| Salmon Sperm DNA | Sigma-Aldrich | D7656 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Storage Phosphor screen and casette | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-74 | |
| Phosphor imager | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon FLA 7000 | |
| UV Crosslinker | Stratagene | Stratalinker 1800 | |
| cling film (Saran wrap) | Omnilabo | 1090681 | |
| Agarose | Thermo Scientific – Invitrogen | 16500 | |
| Boric acid | Merck | 100165 | |
| DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. | MRC Holland | MCT8070 | |
| DNA marker ‘Rood’; DNA ladder | MRC Holland | MCT8080 | |
| Hexanucleotide Mix | Roche | 11277081001 | |
| Large-Construct Kit | Qiagen | 12462 | |
| Heat-sealable polyethylene tubing, clear | various providers | the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane | |
| Heat sealer | |||
| Membrane filter disk | Merck | VSWP02500 | |
| Magnesium chloride | Merck | 105833 | |
| Hybridization mesh | GE Healthcare Life Sciences | RPN2519 |
Referencias
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