الكشف عن التنشيط إينفلاماسومي وموت الخلايا بيروبتوتيك في مورين الضامة المشتقة من نخاع العظام
Summary
يصف لنا الكشف عن التنشيط إينفلاماسومي NLRP3 على أساس الخلوية باستخدام مجهر الأسفار وتلطيخ النشطة caspase-1 وفي المحول، الرابطة. ويرد مقايسة الإفراج لاكتات نازعة للكشف عن تحلل بيروبتوتيك على أساس سكان. يمكن تكييفها مع هذه التقنيات لدراسة جوانب كثيرة من الأحياء إينفلاماسومي.
Abstract
إينفلاماسوميس هي الفطرية منصات الإشارات المناعية التي مطلوبة من أجل المكافحة الناجحة للعديد من الكائنات المسببة للأمراض، ولكن أيضا تعزيز التهابات وأمراض أوتوينفلاماتوري. يتم تنشيط إينفلاماسوميس من مستقبلات الاعتراف بنمط سيتوسوليك، بما في ذلك أفراد الأسرة مثل إيماءة مستقبلات (NLR). أوليجوميريزي هذه المستقبلات عند الكشف عن المنبهات الميكروبية أو المرتبطة بالضرر. أشكال التوظيف اللاحقة من البروتين محول ASC مجهريا مرئية إينفلاماسومي معقدة، مما ينشط caspase-1 عن طريق التنشيط التلقائي الناجم عن قرب. وبعد التنشيط، كليفس caspase-1 برو–إيل-1β والمحترفين-إيل-18، مما يؤدي إلى تنشيط وإفراز هذه السيتوكينات الموالية التحريضية. كما يتوسط Caspase-1 شكل موت الخلية يسمى بيروبتوسيس، الذي يتميز بفقدان غشاء النزاهة وخلية تفسخ التحريضية. كليفس Caspase-1 جاسديرمين د، الإفراج عن الجزء الطرفي ن الذي يشكل غشاء البلازما المسام، مما يؤدي إلى تحلل ناضح.
يمكن تحديد في المختبر، تفعيل caspase-1 وضع العلامات المشتقة من نخاع العظم الضامة مع المسبار caspase-1 نشاط الاتحاد الماليزي-يفاد-مارك فنلندي، وتسمية الخلايا مع الأجسام المضادة ضد بروتين محول ASC. هذا الأسلوب يسمح تحديد تشكيل إينفلاماسومي وتفعيل caspase-1 في الخلايا الفردية باستخدام مجهر الأسفار. ويمكن الكشف عن موت الخلية بيروبتوتيك بقياس إطلاق سراح سيتوسوليك اللاكتات نازعة في المتوسط. هذا الإجراء بسيطة وفعالة من حيث التكلفة وتنفيذه في شكل لوحة 96-جيدا، والسماح للتكيف للفحص. في هذه المخطوطة، نظهر أن تنشيط إينفلاماسومي NLRP3 من نيجيريسين يؤدي إلى توطين المشارك محول البروتين ASC ونشط caspase-1، مما يؤدي إلى بيروبتوسيس.
Introduction
التهاب إينفلاماسومي بوساطة هو عنصر حاسم للدفاع ضد1من الكائنات المسببة للأمراض، ولكن أيضا يكمن وراء مسببات العديد من الأمراض2. الاستجابة الالتهابية لمجموعة واسعة من الإصابات يتم تشغيلها بواسطة الكشف عن سيتوسوليك من مسببات الأمراض المرتبطة أنماط الجزيئية (بامبس) أو الأضرار المرتبطة أنماط الجزيئية (دامبس). نمط الاعتراف مستقبلات (بر)، بما في ذلك أفراد الأسرة مثل إيماءة مستقبلات (NLR)، أوليجوميريزي عند الكشف عن هذه بامبس ودامبس. هذا بتشغيل تشكيل مجمع متعدد البروتين يسمى إينفلاماسومي، الذي يحتوي على بر، البروتين محول المرتبطة استموات بقعة تشبه البروتين التي تحتوي على مجال caspase-توظيف ج-طرفية (بطاقة) (ASC) والمؤيدة شكل ،كاسباسي-134. ويسمح هذا المجمع التنشيط التلقائي المستحثة بالقرب من كاسباسي-1. ثم نشط caspase-1 يؤدي إلى مجموعة من الأحداث التي تتميز بها بيروبتوسيس مسار موت الخلية الملتهبة. وتشمل هذه الأحداث: الانقسام والإفراج عن السيتوكينات الالتهابية 1β إيل وايل-18، الرقابة يحلول مع الإفراج عن محتويات الليزوزومية في الفضاء خارج الخلية، والتكثيف النووية، والانقسام جاسديرمين د. إدراج المجال الطرفي ن المفرج عنهم من جاسديرمين د في غشاء البلازما، تشكيل المسام التي تسبب تمزق الأغشية البلازمية والإفراج عن محتويات التحريضية، بالإضافة إلى أخذ مكانة واقية الممرض النسخ المتماثل5، 6 , 7.
هنا، علينا أن نركز على إينفلاماسومي NLRP3 مدروسة. تفعيل إينفلاماسومي NLRP3 يحدث من خلال عملية ذات خطوتين8. يحدث “فتيلة” الخطوة الأولى من خلال الاعتراف المستقبلات الشبيهة بعدد القتلى (TLR) من منتج الميكروبية. ويتكرر هذا في إنشاء مختبر باستخدام لبس لتحفيز TLR4. هذا التحفيز أوبريجولاتيس NLRP3 والمحترفين-إيل-1β من خلال إشارات NF-كيلو بايت. تراخيص NLRP3 من خلال آليات غير النسخي بحمل ديوبيكويتينيشن9،10 والفسفره أو ديفوسفوريليشن من المخلفات المحددة11،12به فتيلة بالإضافة إلى ذلك.
ويعتقد أن تنطوي على عوامل mitochondrial والأنواع الأكسجين التفاعلية، افلوكس البوتاسيوم والكالسيوم الإشارات، على الرغم من أن إليه موحدة لتفعيل NLRP3 ما زال بعيد المنال8الإشارة الثانية لتنشيط NLRP3. NLRP3 تنشيط أوليجوميريزيس من خلال التفاعلات بين المجالات NACHT لها، والمجندين الرابطة عن طريق الربط بين المجالات بيرين (بيد)13. وتشكل هذه المجمعات الجزيئات في كل خلية، تركيز مجهريا مرئية واحدة. واعتبرت الرابطة أصلاً بروتين كاتشين 22 الذي يشكل “ذرة” أثناء [ابوبتوسس] خلايا سرطان الدم البشري، والمسماة المرتبطة استموات بقعة تشبه البروتين الذي يحتوي على بطاقة14. وتقرر في وقت لاحق أن المجندين ASC برو-كاسباسي-1 من خلال تفاعل بطاقة للرابطة مع بطاقة برو-كاسباسي-1 وتشكيل إينفلاماسومي15.
نلرس ليست كلها تتطلب وجود الرابطة للحث على تفعيل caspase-1. وخلافا NLRP3، NLRC4 و NLRP1b بطاقة المجالات ويمكن توظيف مباشر برو-كاسباسي-1 عن طريق التفاعلات بطاقة للحث على تفعيل caspase-1. نظراً لغياب الرابطة، ما زالت منتشرة في جميع أنحاء سيتوسول النشطة caspase-1 ولا تشكل بؤرة واحدة. هذا منتشرة نشطة caspase-1 يكفي للحث على موت الخلايا بيروبتوتيك، ولكن غير قادر على معالجة برو–إيل-1β13،16.
سوف نناقش في هذه المخطوطة، هناك طريقتان لتقييم تفعيل إينفلاماسومي. يستخدم الأول نشاط الفلورسنت التحقيق، الاتحاد الماليزي-إيفاد-مارك فنلندي، الذي يربط الأسرة caspase-1 من البروتياز. وتشمل هذه العائلة caspase-1، لكن أيضا الماوس caspase-11 والبشرية caspase-4 و caspase-5. وستعالج باستخدام الضامة من caspase-1/11 ناقص الفئران في جميع التجارب، خصوصية هذا التحقيق. هذا الأسلوب يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع جسم العلامات من مكونات إينفلاماسومي، الذي سوف يصف لنا أيضا. يسمح التصور المجهري لتحديد خلايا فردية تتضمن النشطة caspase-1، والرابطة أوليجوميريزيد. باستخدام هذا الأسلوب، سوف تكون قادرة على تحديد أين في تتالي تشكيل إينفلاماسومي التلاعب بهم من الخلية المضيفة أو الكائنات المسببة للأمراض قيد الدراسة لها أثر الباحثين. على سبيل المثال، يمكن للمرء أن يميز سواء بتدخل معين يحول دون توظيف ASC إلى NLRP3 معقدة أو يستهدف تجنيد اللاحقة وتفعيل caspase-117. دراسة نتائج تفعيل caspase-1 مثل إفراز 1β إيل لن قادراً على التمييز بين هذه الإمكانيات اثنين. أيضا، يمكن تغيير إفراز 1β إيل دون تغيير الخلايا القدرة على تفعيل caspase-1 والخضوع لموت الخلايا بيروبتوتيك16.
الأسلوب الثاني تدابير الإفراج نازعة لاكتات (رابطة حقوق الإنسان) في الخلية طافية، الذي يحدث أثناء بيروبتوتيك بلعم تحلل بعد تفعيل caspase-1 كما هو موضح أعلاه. هذا الأسلوب الثاني اتباع نهج قائم على السكان كما الإفراج عن رابطة حقوق الإنسان في جميع أنحاء جيدا يتم قياس. يسمح للتحليل السريع (30 دقيقة من وقت الحضانة) للعينات لتحديد ما إذا كان هناك موت الخلية caspase-1-بوساطة هذا النهج بسيطة ويمكن أن يتم في شكل لوحة 96-جيدا.
هذه الأساليب مكملة، وكل منهما مزايا مختلفة، وكلاهما قابلة بسهولة للتعديلات. على سبيل المثال، يمكن استخدام العلاج بلعم مع مركبات الوزن الجزيئي الصغيرة المستهدفة قبل التحفيز إينفلاماسومي للتحقيق في دور بعض البروتينات قد يكون على التحكم في ردود تحريضية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد قدمنا في هذه المخطوطة، اثنين من التقنيات لبحث تفعيل إينفلاماسومي ونتيجة لتفعيل caspase-1 أثر التحفيز NLRP3 في مورين الضامة المشتقة من نخاع العظام. الأسلوب الأول يسمح للباحث تحديد مستوى تفعيل caspase-1 على أساس خلوي استخدام المراسل الفلورسنت الاتحاد الماليزي-إيفاد-مارك فنلندي. هذا المراسل محددة…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم الفحص المجهري كل كيك جورج م. مركز الفحص المجهري مع دعم من بيترز ناثانيال وبدعم من المعاهد الوطنية للصحة جائزة S10OD016240. S.L.F. معتمد من قبل المعهد الوطني للصحة K08AI119142 و R21AI130281. ونحن نشكر الدكتور ريتشارد Flavell والدكتور براد كوكسون للفئران ناقصة caspase-1/11، والدكتور براد كوكسون لتقاسم مرافق المختبرات والمعدات.
Materials
| E-MEM | ATCC | 30-2003 | For growing L929 cells |
| NCRC clone 929 (L929) | ATCC | CCL-1 | |
| Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde |
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay | Fisher Scientific | PR-G1780 | Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid |
| FAM-YVAD-FMK | Immunocytochemistry Technologies | 98 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Invitrogen | 11960044 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium | Invitrogen | 14190144 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin | Invitrogen | 26140079 | Heat inactivated at 55°C for 50 min |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| ProLong Gold Mounting Medium | Invitrogen | p36934 | Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46 |
| goat anti-mouse ALEXA555 | Invitrogen | A-21422 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Invitrogen | 11344041 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| TO-PRO-3 Iodide | Invitrogen | T3605 | far-red fluorescent nucleic acid stain |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratoy | 000664 | |
| caspase-1/11-/- mouse | Jackson Laboratory | 016621 | |
| Leica SP8X Confocal Microscope | Leica | ||
| Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) | List Biologicals | 434 | |
| anti-ASC clone 2EI-7 | Millipore-Sigma | 04-417 | |
| beta-mercapto-ethanol | Millipore-Sigma | M6250-10ML | |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650-5X10ML | |
| EDTA | Millipore-Sigma | E5391 | |
| Spectramax M3 plate reader | Molecular Devices | 5000414 |
Referencias
- Jorgensen, I., Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).
- Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. T. Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat Rev Microbiol. 7 (2), 99-109 (2009).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cell Microbiol. 8 (11), 1812-1825 (2006).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., den Hartigh, A. B., Loomis, W. P., Cookson, B. T. Coordinated host responses during pyroptosis: caspase-1-dependent lysosome exocytosis and inflammatory cytokine maturation. J Immunol. 187 (5), 2748-2754 (2011).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Sutterwala, F. S., Haasken, S., Cassel, S. L. Mechanism of NLRP3 inflammasome activation. Ann N Y Acad Sci. 1319, 82-95 (2014).
- Juliana, C., et al. Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation. J Biol Chem. 287 (43), 36617-36622 (2012).
- Py, B. F., Kim, M. S., Vakifahmetoglu-Norberg, H., Yuan, J. Deubiquitination of NLRP3 by BRCC3 critically regulates inflammasome activity. Mol Cell. 49 (2), 331-338 (2013).
- Song, N., et al. NLRP3 Phosphorylation Is an Essential Priming Event for Inflammasome Activation. Mol Cell. 68 (1), 185-197 (2017).
- Stutz, A., et al. NLRP3 inflammasome assembly is regulated by phosphorylation of the pyrin domain. J Exp Med. 214 (6), 1725-1736 (2017).
- Broz, P., Dixit, V. M. Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling. Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).
- Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).
- Yamamoto, M., et al. ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules. Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).
- Miao, E. A., Rajan, J. V., Aderem, A. Caspase-1-induced pyroptotic cell death. Immunol Rev. 243 (1), 206-214 (2011).
- LaRock, C. N., Cookson, B. T. The Yersinia virulence effector YopM binds caspase-1 to arrest inflammasome assembly and processing. Cell Host Microbe. 12 (6), 799-805 (2012).
- Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect Immun. 63 (9), 3609-3620 (1995).
- Miller, S. I., Ernst, R. K., Bader, M. W. LPS, TLR4 and infectious disease diversity. Nat Rev Microbiol. 3 (1), 36-46 (2005).
- Sester, D. P., et al. A novel flow cytometric method to assess inflammasome formation. J Immunol. 194 (1), 455-462 (2015).
- Sester, D. P., et al. Assessment of Inflammasome Formation by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2016).
- DiPeso, L., Ji, D. X., Vance, R. E., Price, J. V. Cell death and cell lysis are separable events during pyroptosis. Cell Death Discov. , (2017).
- Russo, H. M., et al. Active Caspase-1 Induces Plasma Membrane Pores That Precede Pyroptotic Lysis and Are Blocked by Lanthanides. J Immunol. 197 (4), 1353-1367 (2016).
- Evavold, C. L., et al. The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages. Immunity. , (2017).
