Describimos la detección de la activación de inflammasome NLRP3 en bases celulares mediante microscopía de fluorescencia y la coloración para activa caspasas-1 y el adaptador, ASC. Un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa se presenta para detectar lisis pyroptotic sobre una base de población. Estas técnicas se pueden adaptar para estudiar muchos aspectos de la biología de inflammasome.
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Artículo de método
Detección de Inflammasome activación y muerte celular Pyroptotic en macrófagos derivados de médula ósea murinas
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Resumen
Resumen
Inflammasomes son plataformas señalización inmunes innatas que se requieren para el control exitoso de muchos organismos patógenos, sino que también promueven inflamatorias y enfermedades autoinflamatorias. Inflammasomes son activadas por receptores de reconocimiento de patrón citosólica, incluyendo a miembros de la familia de NOD-like receptor (NLR). Estos receptores oligomerize a la detección de estímulos microbianos o asociada a daño. Posterior reclutamiento de la proteína adaptador ASC forma un microscópico visible inflammasome complex, que activa la caspasa-1 a través de la auto activación inducida por proximidad. Después de la activación caspase-1 segmenta pro-IL-1β y pro-IL-18, conduciendo a la activación y secreción de estas citoquinas proinflamatorias. Caspasa-1 interviene también en la forma inflamatoria de muerte celular denominada pyroptosis, que cuenta con la pérdida de la lisis de integridad y de la célula de la membrana. Caspasa-1 golpea a gasdermin D, soltar el fragmento N-terminal que forma poros en membrana del plasma, llevando a la lisis osmótica.
In vitro, la activación de caspasa-1 se puede determinar por macrófagos derivados de médula ósea con la punta de prueba de actividad de caspasa-1 FAM-YVAD-FMK de etiquetado y etiquetado las células con anticuerpos contra la proteína adaptadora de ASC. Esta técnica permite la identificación de inflammasome formación y activación de la caspasa-1 en células individuales utilizando microscopía de fluorescencia. Pyroptotic la muerte celular puede detectarse midiendo la liberación de lactato deshidrogenasa citosólica en el medio. Este procedimiento es simple, rentable y en un formato de placa de 96 pocillos, permitiendo la adaptación para la investigación. En este manuscrito, nos muestran que la activación de la inflammasome NLRP3 por nigericin conduce a la colocalización de la proteína adaptadora de ASC y activa caspasas-1, a pyroptosis.
Introducción
Inflamación mediada por Inflammasome es un componente crítico de la defensa contra organismos patógenos1, pero también es la base de la etiología de muchas enfermedades2. Citosólica detección de patrones moleculares asociado de patógeno (PMAP) activa la respuesta inflamatoria a una amplia gama de infecciones o daños asociados patrones moleculares (DAMPs). Receptores de reconocimiento de patrón (PRR), incluyendo a miembros de la familia NOD-like receptor (NLR), oligomerize a la detección de estos PAMPs y humedades. Esto provoca la formación de un complejo de varias proteína denominado inflammasome, que contiene el PRR, la....
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Protocolo
Todos los procedimientos animales eran aprobados y llevado a cabo en la Universidad de Washington institucional Animal Care y Comité de uso.
1. la cosecha de médula ósea
- Asépticamente Remueva el fémur y la tibia de un ratón y limpiar los huesos usando instrumentos estériles. Coloque los huesos limpios en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) + 5 mM HEPES 0,2 mg/mL de L-glutamina + 0,05 mM 2-Mercaptoetanol + 50 mg/mL gentamicina Sulfato + 10.000 U/mL de penicilina/estreptomicina + 10% de suero bovino fetal (FBS, DMEM-10 completa) e incube la el tubo en hielo por 15 min.
- Eliminar las juntas de rótula proximal y dist....
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Resultados
Para detectar la activación de la caspasa-1 después de la exposición a nigericin, las células se procesaron como se describe en la sección de protocolo. Combinamos la FAM-YVAD-FMK y ASC anticuerpo etiquetado para demostrar que el ASC y activa caspase-1 co localización tras inflammasome NLRP3 mediada por activación. Figura 1A muestra que el tipo salvaje macrófagos expuestos a 5 μM nigericin tienen formación de un enfoque de la ASC en la región perinuclear. Est.......
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Discusión
En este manuscrito, hemos presentado dos técnicas para examinar la activación inflammasome y la consecuencia de la activación de la caspasa-1 después del estímulo NLRP3 en macrófagos derivados de médula ósea murinos. La primera técnica permite al investigador determinar el nivel de activación de la caspasa-1 basándose en los celulares usando el reportero fluorescente FAM-YVAD-FMK. Este reportero es altamente específico para atar la caspasa-1 familia de enzimas, como se ve por la ausencia de tinción en macrófagos deficien.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de interés divulgar
Agradecimientos
Todos la microscopia se realizó en el centro W. M. Keck microscopia con el apoyo de Nathaniel Peters y con el apoyo del Premio NIH S10OD016240. Y es apoyada por los NIH K08AI119142 y R21AI130281. Agradecemos al Dr. Richard Flavell y Dr. Brad Cookson de ratones deficientes caspase-1/11 y el Dr. Brad Cookson para compartir equipos y laboratorios.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| E-MEM | ATCC | 30-2003 | Para el cultivo de células L929 |
| Clon NCRC 929 (L929) | ATCC | CCL-1 | |
| Kit de Fijación/Permeabilización BD | Biosciences | 554714 | Incluye solución de fijación y permeabilización, y tampón de lavado. Formulaciones patentadas. Contiene 4,2% de formaldehído |
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Cytotox96 Ensayo de citotoxicidad no radiactiva | Fisher Scientific | PR-G1780 | Incluye mezcla de sustrato y tampón de ensayo; Formulaciones patentadas. La solución de parada es 1 M Ácido acético |
| FAM-YVAD-FMK | Immunocytochemistry Technologies | 98 | |
| DMEM, alto en glucosa, sin glutamina | Invitrogen | 11960044 | |
| DMEM, alto en glucosa, sin glutamina, sin rojo de fenol | Invitrogen | 31053028 | |
| PBS de Dulbecco, sin calcio, sin magnesio | Invitrogen | 14190144 | |
| Suero fetal bovino, calificado, origen de EE. UU. | Invitrogen | 26140079 | Heat inactivado a 55 ° C durante 50 min |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| ProLong Gold Mounting Medium | Invitrogen | p36934 | Formulación patentada. Medio de montaje de curado. Se endurece a un índice refractario de 1,46 |
| ALEXA555 anti-ratón | de cabra Invitrogen | A-21422 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Invitrogen | 11344041 | |
| L-Glutamina | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Invitrogen | 15140122 | |
| TO-PRO-3 Iduro | Invitrogen | T3605 | rojo lejano fluorescente tinción de ácido nucleico |
| C57BL/6J ratón | Jackson Laboratoy | 000664 | |
| caspasa-1/11-/- ratón | Jackson Laboratory | 016621 | |
| Microscopio confocal Leica SP8X | Leica | ||
| Ultrapure LPS de Salmonella minnesota R595 (Re) | List Biologicals | 434 | |
| clon anti-ASC 2EI-7 | Millipore-Sigma | 04-417 | |
| beta-mercapto-etanol | Millipore-Sigma | M6250-10ML | |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650-5X10ML | |
| EDTA | Millipore-Sigma | E5391 | |
| Spectramax M3 lector de placas | Molecular Devices 5000414 |
Referencias
- Jorgensen, I., Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).
- Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21 (7), 677....
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Reimpresiones y permisos
