ديسثيوبيوتين-ستريبتافيدين-تقارب وساطة تنقية الحمض النووي الريبي تتفاعل البروتينات في خلايا ورم الظهارة المتوسطة
Summary
وسم ديسثيوبيوتين من الاصطناعية في اليغو رنا 25-النوكليوتيدات، الذي يحتوي فكرة الغنية الأدنين عنصر (ARE)، يسمح ملزمة محددة من سيتوسوليك هي ملزمة البروتين.
Abstract
في المختبر المنسدلة الحمض النووي الريبي لا تزال إلى حد كبير يستخدم في الخطوات الأولى للبروتوكولات الرامية إلى تحديد البروتينات الحمض النووي الريبي الملزمة التي تعترف بهياكل الحمض النووي الريبي وزخارف محددة. في هذا البروتوكول المنسدلة الجيش الملكي النيبالي، تتم تسمية المركب تجارياً الحمض النووي الريبي تحقيقات مع صيغة معدلة من البيوتين، ديسثيوبيوتين، في المحطة 3 ‘ من حبلا الجيش الملكي النيبالي، الذي عكسية بربط streptavidin، ويسمح بالتالي شطف بروتينات تحت أكثر فسيولوجية شروط. الجيش الملكي النيبالي–ديسثيوبيوتين هو المعطل تداولها من خلال التفاعل مع ستريبتافيدين على حبات المغناطيسية، التي تستخدم لهدم البروتينات على وجه التحديد تتفاعل مع الحمض النووي الريبي للفائدة. وتستخدم كمصدر للبروتينات البروتينات عدم-التشويه والتحريف والنشطة من الكسر سيتوسوليك من خلايا ورم الظهارة المتوسطة. يمكن تطبيق الطريقة الموضحة هنا للكشف عن التفاعل بين الجيش الملكي النيبالي المعروف ملزم البروتينات ومجس الحمض النووي الريبي طويل 25-النوكليوتيدات (nt) التي تحتوي على تسلسل فائدة. وهذا مفيد لاستكمال توصيف وظيفي استقرار أو زعزعة استقرار العناصر الموجودة في جزيئات الحمض النووي الريبي تحقيقه باستخدام مقايسة متجه مراسل.
Introduction
التعبير الجيني والمستوى النهائي للمنتج الجيني يمكن أحكام ينظمها التي تؤثر على استقرار مرناً ومرناً الترجمة معدل1. هذه الآليات التنظيمية بوستترانسكريبشونال تمارس عن طريق التفاعلات غير الترميز الحمض النووي الريبي و/أو الحمض النووي الريبي ملزم البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية) مع مرناً المستهدفة. أنها عادة ما تكون المنطقة 3 ‘غير مترجمة من مرناً (3’ UTR-الذين ينتمون إلى الجزء غير ترميز الجينوم2) الذي يحتوي على محدد رابطة الدول المستقلة-العناصر التنظيمية (CRE)، التي تعترف بها ترانس-تعمل بعوامل مثل ميرنا أو الممارسات التجارية التقييدية 3-درس أفضل رابطة الدول المستقلة-هو عنصر داخل 3 ‘ UTR، عزر الأدنين-الغنية بعنصر (ARE)، الذي يعترف بالبروتينات الاتحاد الأفريقي ملزمة محددة (أوبب)، وفي المقابل، يدفع أما مرناً تدهور/ديدينيليشن (هي بوساطة تسوس) أو مرناً الاستقرار4.
الحجم 3 ‘ UTR من كالريتينين مرناً (CALB2) هو 573 bp طويلة ويحتوي بينتامير أويووا المفترضة، كما تنبأ بها AREsite2، أداة بيوينفورماتيك5. تمشيا مع وجود فكرة هي المفترضة، تحليل المتجهات-مراسل بميرجلو أظهر بدور تحقيق استقرار لهذا العنصر داخل مرناً CALB26. وأخيراً، في المختبر المنسدلة الحمض النووي الريبي استخدمت لتحديد أوبب أن تستقر كالريتينين مرناً من خلال فكرة هي.
منذ الكشف غير ترميز جميع تتفاعل مع البروتينات7، في المختبر المنسدلة الحمض النووي الريبي هو طريقة جيدة والفحص الأولى للاختيار لتحديد الحمض النووي الريبي-التمثيلات للمساعدة في فك رموز الآليات الجزيئية. واستخدمت في هذا الأسلوب، والجيش الملكي النيبالي-المنسدلة المركب تجارياً تحقيقات الجيش الملكي النيبالي، الذي تم تسميته بصيغة معدلة من البيوتين (ديسثيوبيوتين) في المحطة 3 ‘ من حبلا الحمض النووي الريبي،. الجيش الملكي النيبالي–ديسثيوبيوتين هو المعطل تداولها من خلال التفاعل مع ستريبتافيدين على حبات المغناطيسية، التي تستخدم لهدم البروتينات التي تتفاعل على وجه التحديد مع ربط-الجيش الملكي النيبالي للفائدة. وتستخدم كمصدر للبروتينات البروتينات عدم-التشويه والتحريف والنشطة من الكسر سيتوسوليك من خلايا ورم الظهارة المتوسطة. يتم التيد مثل البروتينات المرتبطة الحمض النووي الريبي من الخرز المغناطيسي، تشغيل من خلال جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 12% ونقلت لغشاء وسبر مع الأجسام المضادة المختلفة.
في معيار streptavidin-البيوتين تقارب تنقية الإجراء، تمسخ قاسية هي الشروط اللازمة لعرقلة بوند البيوتين لا رجعة قوية-ستريبتافيدين الوت البروتينات منضم8، مما قد يؤدي إلى الانفصال من مجمعات البروتين. خلافا البيوتين، ديسثيوبيوتين عكسية بربط streptavidin وشرد تنافسية مع حل مخزنة من البيوتين، مما يسمح شطف لطيف من البروتينات، وتجنب عزل بطبيعة الحال بيوتينيلاتيد الجزيئات9، مما يدل على أن هذه التقنية مثالية لعزل مجمعات البروتين الأصلي تحت ظروف السكان الأصليين.
ينبغي أن تكون قريبة من تلك الموجودة في سياق الخلوية في المختبر الشروط الملزمة والتقشف، التي يتم تحديدها بواسطة تركيز الملح وعوامل تخفيض النسبة المئوية المنظفات، بغية تحديد التفاعلات الحقيقية في فيفو . لقد ثبت شروط ملزمة تنفيذ هذه الوثيقة سابقا حسب الاقتضاء لتحديد هور الاتحاد الأفريقي ملزمة بروتين10. هذا النهج يمكن أن تنقذ الوقت، نظراً للاستفادة المثلى شروط الربط السليم يمكن أن تكون صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب يمكن أن تستخدم كبروتوكول انطلاق لأي تجربة المنسدلة الجيش الملكي النيبالي ويمكن أن يكون الأمثل تدريجيا بتغيير تركيز الأملاح والمنظفات وتغيير النسبة المئوية والغليسيرول وإضافة الأملاح الأخرى. وعلاوة على ذلك، أثبتنا أن حتى قصير 25-النوكليوتيدات الجيش الملكي النيبالي-تحقيق إيواء بينتامير هي فكرة يمكن أن تستخدم لإظهار التفاعل مع أوبب محددة.
Protocol
Representative Results
Discussion
3 ‘ تحيلها تنتمي إلى الجينوم غير الترميز3، والكشف غير ترميز كافة يمكن أن تتفاعل مع البروتينات لممارسة هذه الوظيفة7. عندما وجد أن تكون نسخها شوهها الجينوم الثدييات وتنتج جزءا كبيرا من وقت طويل فضله الكشف16، الناشئة الأدلة أثبتت أن هذه الكشف الطويل فضله ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بتأييد هذا العمل بالمنحة السويسرية سينيرجيا مؤسسة العلوم الوطنية CRSII3 147697 für ستيفتونغ كريبسفورشونج أنجيواندتي وكريبسليجا Zürich.
Materials
| NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher Scientific | A32965 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit | Thermo Fisher Scientific | 20164 | Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C |
| Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific | 20163 | The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C). |
| DynaMag-2, magnetic stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Anti – HuR (MOUSE) monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | – | The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit – 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti – α – tubulin (MOUSE) monoclonal antibody | Santa Cruz | 8035 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti – PARP (RABBIT) Polyclonal antibody | Cell Signaling | 9542 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti – Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody | Rockland | 200-301-A87 | |
| Secondary goat anti-rabbit antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Secondary rabbit anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A-9044 | |
| RPMI – 1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| FBS – Filtrated Bovine Serum | Pan Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin – streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamine solution (200 mM) | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life technologies | 25200-056 | |
| Mini-PROTEAN 3 Cell | Bio-Rad | 1653301 | |
| Mini Protean System Glass Plates | Bio-Rad | 1653308 | |
| Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer | Bio-Rad | 1653312 | |
| Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL | Bio-Rad | 1653365 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules | Bio-Rad | 1658050 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Rotiphorese gel 30 – aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1 | Roth | 3029 | |
| 20% SDS | PanReac AppliChem | A3942 | |
| PVDF transfer membrane | Perkin Elmer | NEF1002 | Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min |
| Trans-Blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad | 1705061 | |
| FusionFX Digital Imager | Vilber | – | |
| RNA oligo synthesis | Mycrosynth AG, Switzerland | – | the synthesis scale – 0.04 µmol – HPLC purified |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Hydrochloric Acid (HCl) 6 M | PanReac AppliChem | 182883.1211 | |
| Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | 50% sterile aliquots to be stored at -20°C |
| Pierce Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88817 | Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 – 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process. |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Coomassie G-250 | Applichem | A3480 | |
| Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate | Sigma-Aldrich | 368458 | |
| ortho-phosphoric acid | Applichem | A0637 |
Referencias
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3’UTRs. Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3′ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).
- von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. E. Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2 (3), 336-347 (2011).
- Fallmann, J., Sedlyarov, V., Tanzer, A., Kovarik, P., Hofacker, I. L. AREsite2: An enhanced database for the comprehensive investigation of AU/GU/U-rich elements. Nucleic Acids Research. 44, D90-D95 (2016).
- Kresoja-Rakic, J., et al. Posttranscriptional regulation controls calretinin expression in malignant pleural mesothelioma. Frontiers in Genetics. 8 (70), (2017).
- Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (1), 29-35 (2015).
- Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clinical Chemistry. 37 (5), 625-636 (1991).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- . Magnetic bead technology for better assay development Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf (2013)
- Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Coulson, R. M., Cleveland, D. W. Ferritin synthesis is controlled by iron-dependent translational derepression and by changes in synthesis/transport of nuclear ferritin RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (16), 7613-7617 (1993).
- Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5′ untranslated region of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (7), 2171-2175 (1988).
- Srikantan, S., Gorospe, M. HuR function in disease. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 17, 189-205 (2012).
- Morris, K. V., Mattick, J. S. The rise of regulatory RNA. Nature Reviews: Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).
- Rinn, J. L., et al. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs. Cell. 129 (7), 1311-1323 (2007).
- Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322 (5902), 750-756 (2008).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
