Desthiobiotin-estreptavidina-afinidad mediada por purificación de proteínas de interacción con RNA en células de mesotelioma

Resumen

Desthiobiotin etiquetado de un sintético 25-nucleótido RNA oligo, que contiene un motivo de elementos ricos en adenina (ARE), permite la unión específica de proteína citosólica son.

Resumen

El en vitro RNA-telecine se utiliza todavía en gran parte en los primeros pasos de protocolos dirigidos a identificar proteínas de unión de ARN que reconocen determinados motivos y estructuras de ARN. En este protocolo de RNA-telecine, comercialmente sintetizadas sondas de RNA están marcadas con una forma modificada de la biotina, desthiobiotin, en el 3' terminal del filamento del RNA, que se une reversiblemente a estreptavidina y permite así la elución de proteínas bajo más fisiológica condiciones. El RNA-desthiobiotin se inmoviliza mediante la interacción con estreptavidina en granos magnéticos, que se utilizan para tirar abajo proteínas que interaccionan específicamente con el RNA de interés. Proteínas no desnaturalizadas y activas de la fracción citosólica de las células del mesotelioma se utilizan como fuente de proteínas. El método aquí descrito puede aplicarse para detectar la interacción entre proteínas RNA conocidas y una sonda de RNA largo (nt) de 25 nucleótidos que contiene una secuencia de interés. Esto es útil para completar la caracterización funcional de estabilizar o desestabilizar elementos presentes en las moléculas de ARN alcanzadas usando un análisis de vectores de reportero.

Introducción

Expresión génica y el nivel final del producto del gene pueden ser reguladas fuertemente afectando la estabilidad del ARNm y ARNm traducción tarifa¹. Estos mecanismos de regulación postranscripcional se ejercen a través de las interacciones de no codificante del RNA y RNA-que ata las proteínas (restrictivas) con el mRNA específicos. Generalmente es el 3' región sin traducir de mRNA (3' UTR - pertenecientes a la parte no codificante del genoma²) que contiene específico cis-elementos reguladores (CRE), que son reconocidos por trans-actúan factores como miRNA o restrictivas ³. el me....

Protocolo

1. preparación de la fracción de proteínas citosólicas y nucleares

1. Placa 4 x 10⁶ ACC-MESO-4 células en un frasco de cultivo celular T150 cultivadas en RPMI - 1640 medio suplementado con 10% FBS, 1 x penicilina/estreptomicina (100 x) y 2 mM L-glutamina (200 mM). Cuando las células alcanzan una confluencia del 80-90% (~5-5.5 x 10⁶ células), proceder a la extracción de proteínas de la fracción nuclear y citosólica.
   Nota: Línea de celular de ACC-MESO-4 se obtuvo de la RIKEN BioResource centro¹¹.
2. Aspire medio, lave las células añadiendo 15 mL de PBS 1 x, incline la placa suavemente unas cuantas veces y as....

Resultados

En este experimento, un fragmento largo 25-nt de calretinin 3' UTR que es motivo (CALB2 3' UTR (son) 25-nt) fue utilizado para probar si se une específicamente a la proteína del antígeno humano R (HuR), un conocido estabilizador de mRNA. Para probar la especificidad del elemento son, un RNA 25 nt sonda CALB2 3' UTR (mtARE) que contiene una mutación son Adorno, que previamente fue demostrada para suprimir el efecto de estabilización del motivo son, fue usado⁶. El AR.......

Discusión

3' UTRs pertenecen al genoma no codificante³, y todos los RNAs no codificantes pueden interactuar con proteínas para ejercer su función⁷. Cuando el genoma mamífero fue encontrado para ser transcrito lo impregna y produjeron una porción significativa de larga noncoding RNAs¹⁶, nuevas evidencias demostraron que estos larga noncoding RNAs función en la regulación de expresión génica al interactuar con remodelación de cromatina complejos

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
NE-PER Kit de extracción nuclear y citoplasmática	Thermo Fisher Scientific	78833
Pierce Tabletas inhibidoras de la proteasa, sin EDTA	Thermo Fisher Scientific	A32965
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit	Thermo Fisher Scientific	20164	Incluye perlas magnéticas y, por lo tanto, el kit debe almacenarse a 4 & grados;
C Pierce ARN 3' Kit de destiobiotinilación	Thermo Fisher Scientific	20163	El kit forma parte del "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit" y debe almacenarse a -20 °C; C, a diferencia del kit desplegable (4 ° C).
DynaMag-2,  soporte magnético	Thermo Fisher Scientific	12321D
Anticuerpo monoclonal Anti - HuR (MOUSE)	Thermo Fisher	Scientific-El	anticuerpo está incluido en el Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit  - 1:1000 en 5% BSA 1x TTBS - anticuerpo secundario anti-ratón de conejo 1:10.000 en 5% BSA 1x TTBS
Anti - &alfa; - tubulina (MOUSE) anticuerpo monoclonal	Santa Cruz	8035	1:1000 en 5% BSA 1x TTBS - anticuerpo secundario anti-ratón conejo 1:10.000 en 5% BSA 1x TTBS
Anti - PARP (CONEJO) Anticuerpo policlonal	Cell Signaling	9542	1:1000 en 5% BSA 1x TTBS - anticuerpo secundario anti-conejo de cabra 1:10.000 en 5% BSA 1x TTBS
Anti - Mesothelin (MOUSE) Anticuerpo Monoclonal	Rockland	200-301-A87
Anticuerpo secundario anti-conejo de cabra	Cell Signaling	7074
Anticuerpo secundario anti-ratón de conejo	Sigma-Aldrich	A-9044
RPMI - 1640 medio	Sigma-Aldrich	R8758
FBS - Suero bovino filtrado	Pan Biotech	P40-37500
Penicilina - estreptomicina (100x)	Sigma-Aldrich	P4333
Solución de L-Glutamina (200 mM)	Sigma-Aldrich	G7513
0.25% Tripsina-EDTA (1x)	Gibco de Life technologies	25200-056
Mini-PROTEAN 3 celdas	Bio-Rad	1653301
Mini Placas de vidrio del sistema Protean	Bio-Rad	1653308
Mini-PROTEAN con espaciador integrado de 1,5 mm	Bio-Rad	1653312
Peine Mini-PROTEAN, 10 pocillos, 1,5 mm, 66 y micro; L	Bio-Rad	1653365
Mini-PROTEAN Módulos de fundición de tetra célula	Bio-Rad	1658050
Solución de descontaminación de RNasa RNaseZap	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Rotiphorese gel 30 - solución madre acuosa de acrilamida y bisacrilamida al 30% a una proporción de 37,5:1	Roth	3029
20% SDS	PanReac AppliChem	A3942
	Perkin Elmer	NEF1002	Debe activarse incubando en metanol puro durante 1 minuto seguido de lavado en agua durante 2 minutos
Célula de transferencia semiseca Trans-Blot SD	Bio-Rad	1703940
Clarity Western ECL Sustrato	Bio-Rad	1705061
FusionFX  Generador de imágenes digital	Vilber-síntesis	de
oligonucleótidos de ARN	Mycrosynth AG, Suiza:		la escala de síntesis - 0,04 y micro; mol -
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A7030
Ácido clorhídrico (HCl) 6 M	PanReac AppliChem	182883.1211
Ultra Puro 1 M Tris, pH 7.5	Thermo Fisher Scientific 15567027
Glicerol	Thermo Fisher Scientific	17904	50% de alícuotas estériles para almacenar a -20 grados; C
Pierce Streptavidin perlas magnéticas	Thermo Fisher Scientific	88817	Tenga en cuenta que estas perlas magnéticas tienen un diámetro promedio de 1 y micro; m (rango de 0,5 a 1,5 y micro; m). Además, Dynabeads-M280 Streptavidin, que son perlas de tamaño homogéneo 2.8 y micro; m, también se utilizan en la extracción de ARN, pero tenga en cuenta que esto puede afectar el proceso de purificación.
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Persulfato de amonio	Sigma-Aldrich	A3678
Coomassie G-250	Applichem	A3480
Sulfato de aluminio-(14-18)-hidratado;	Sigma-Aldrich	368458
ácido ortofosfórico	Pliego	A0637

Placas espaciadoras Membrana de transferencia de PVDF purificada por HPLC