Desthiobiotin-streptavidine-affiniteit gemedieerde zuivering van eiwitten in cellen van mesothelioom RNA-interactie

Summary

Desthiobiotin labeling van een synthetische 25-nucleotide RNA oligo, die een motief adenine-rijke element (ARE) bevat, kunt specifieke binding van cytosolische ARE-bindend-proteïne.

Abstract

De in vitro RNA-pulldown is nog steeds grotendeels gebruikt in de eerste stappen van de protocollen die zijn gericht op het identificeren van RNA-bindende proteïnen die specifieke RNA structuren en motieven herkennen. In dit protocol van RNA-pulldown, commercieel gesynthetiseerde sondes van RNA worden aangeduid met een gewijzigde vorm van biotine, desthiobiotin, aan de 3′-eindpunt van de RNA-strand, dat omkeerbaar bindt aan streptavidine en dus kunt elutie van eiwitten onder meer fysiologische voorwaarden. Het RNA-desthiobiotin is geïmmobiliseerd door middel van interactie met daar op magnetische kralen, die worden gebruikt voor pull-down eiwitten die specifiek interactie met de RNA van belang. Niet-gedenatureerd en actieve eiwitten uit de cytosolische afvalfractie mesothelioom cellen worden gebruikt als de bron van eiwitten. De hier beschreven methode kan worden toegepast om de interactie tussen bekende RNA-bindende proteïnen en een 25-nucleotide (nt) lang RNA sonde met een opeenvolging van belang te detecteren. Dit is handig voor het voltooien van de functionele karakterisering van stabiliseren of destabiliserende elementen aanwezig zijn in de molecules van RNA bereikt met behulp van een verslaggever vector assay.

Introduction

Genexpressie en het uiteindelijke niveau van het gen-product kunnen worden strak geregeld beïnvloeden het mRNA stabiliteits- en mRNA vertaling tarief¹. Deze post-transcriptional regulerende mechanismen worden uitgeoefend door de interacties van niet-coderende RNA en/of RNA-bindende eiwitten (RBPs) met gerichte mRNA. Het is meestal de 3′ niet-vertaalde regio van mRNA (3′ UTR – die behoren tot de niet-coderende deel van het genoom²) waarin specifieke cis-regelgevende elementen (CRE), die worden erkend door trans-factoren zoals miRNA of RBPs handelen ³. de best bestudeerde cis-element binnen de 3′ UTR, is het motief van adenine-rijke element (ARE), dat wordt erkend door specifieke AU-bindende proteïnen (AUBP), en, op zijn beurt, induceert ofwel mRNA afbraak/deadenylation (zijn-gemedieerde verval) of mRNA stabilisatie⁴.

De grootte van de 3-‘ UTR van calretinin is mRNA (CALB2) 573 bp lang en bevat een vermeende AUUUA pentamer, zoals voorspeld door AREsite2, een bioinformatic gereedschap⁵. In overeenstemming met de aanwezigheid van een vermeende zijn motief, de bepaling van de vector-reporter pmirGLO aangetoond de rol van een stabilisatie van dit element binnen CALB2 mRNA⁶. Ten slotte de in vitro RNA-pulldown werd gebruikt voor het identificeren van de AUBP die calretinin stabiliseert mRNA via het motief zijn.

Aangezien alle niet-coderende RNAs interactie met eiwitten⁷, is de in vitro RNA-pulldown een goede manier en een eerste-van-keuze assay voor het identificeren van RNA-interactors om te helpen bij het ontcijferen van de moleculaire mechanismen. Bij deze methode RNA-pulldown werden commercieel gesynthetiseerde RNA sondes, die waren gelabeld met een gewijzigde vorm van Biotine (desthiobiotin) in het terminus 3′ van de streng RNA, gebruikt. Het RNA-desthiobiotin is geïmmobiliseerd door middel van interactie met daar op magnetische kralen, die worden gebruikt voor pull-down eiwitten die specifiek interactie met de gebonden-RNA van belang. Niet-gedenatureerd en actieve eiwitten uit de cytosolische afvalfractie mesothelioom cellen worden gebruikt als de bron van eiwitten. Dergelijke RNA-afhankelijke eiwitten worden van de magnetische kralen, uitgevoerd door een 12% SDS-pagina gel, overgebracht naar een membraan en peilden met verschillende antilichamen geëlueerd.

Volgens de standaard streptavidine-Biotine affiniteit zuivering, harde denaturatie voorwaarden moet worden voldaan aan het verstoren van de sterke onomkeerbare Biotine-streptavidine bond om elueer de afhankelijke eiwitten⁸, kan leiden tot de dissociatie van eiwitcomplexen. In tegenstelling tot biotine, desthiobiotin omkeerbaar bindt aan streptavidine en concurrerend wordt verplaatst met een gebufferde oplossing van biotine, rekening houdend met de zachte elutie van eiwitten, en het vermijden van het isolement van natuurlijk biotinyleerd moleculen⁹, suggereren dat de techniek ideaal is voor het isoleren van inheemse eiwitcomplexen inheemse omstandigheden.

In vitro bindende voorwaarden en striktheid, die worden bepaald door de zoutconcentratie, reductoren en wasmiddel percentage, moet dicht bij de aanwezigen in het cellulaire kader teneinde waar in vivo interacties. De bindende voorwaarden hierin geïmplementeerd hebben eerder aangetoond zo geschikt is voor de identificatie van de HuR als een AU-bindende eiwit¹⁰. Deze aanpak bespaart tijd, omdat optimalisatie van goede bindende voorwaarden kan tijdrovend en uitdagend. Bovendien, deze methode kan worden gebruikt als een startende protocol voor elke RNA-pulldown experiment en geleidelijk kan worden geoptimaliseerd door het veranderen van de concentratie van zouten en detergenten, het wijzigen van het percentage glycerol en andere zouten toe te voegen. Bovendien, we laten zien dat zelfs een korte 25-nucleotide RNA-sonde herbergen een pentamer zijn-motief kan worden gebruikt om aan te tonen van de interactie met een specifieke AUBP.

Protocol

1. bereiding van cytosolische en nucleaire eiwitoplossing Plaat 4 x 106 ACC-MESO-4 cellen in een kolf met cel cultuur van T150 is gegroeid in RPMI – 1640 medium aangevuld met 10% FBS, 1 x penicilline/streptomycine (100 x) en 2 mM L-Glutamine (200 mM). Wanneer cellen bereikt een samenvloeiing van 80-90% (~5-5.5 x 106 cellen), gaat u verder met eiwit extractie van nucleaire en cytosolische breuk.Opmerking: ACC-MESO-4 cellijn is verkregen uit de RIKEN BioResource centrum…

Representative Results

In dit experiment, was een lang fragment van 25-nt calretinin 3′ UTR herbergen zijn motief (CALB2 3′ UTR (ARE) 25-nt) gebruikt om te testen of het bindt specifiek aan de mens-antigeen R (HuR) eiwit, een bekende mRNA-stabilisator. Als u wilt testen van de specificiteit van het zijn element, een 25-nt-RNA was sonde CALB2 3′ UTR (mtARE) met een mutatie zijn-motief, die eerder af te schaffen het stabilisatie-effect van het zijn motief werd getoond, gebruikte6. De derde…

Discussion

3′ UTRs behoren tot de niet-coderende genoom³, en alle niet-coderende RNAs kunnen communiceren met eiwitten om te oefenen hun functie⁷. Wanneer het genoom van zoogdieren bleek te worden pervasively getranscribeerd en een aanzienlijk deel van lang noncoding RNAs¹⁶geproduceerd, opkomende bewijzen aangetoond dat deze lange-noncoding RNAs functioneren bij de regulering van de expressie van genen zoals ze met interageren chromatine-remodeling complexen<su…

Materials

NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit	Thermo Fisher Scientific	78833
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free	Thermo Fisher Scientific	A32965
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit	Thermo Fisher Scientific	20164	Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C
Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit	Thermo Fisher Scientific	20163	The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C).
DynaMag-2,  magnetic stand	Thermo Fisher Scientific	12321D
Anti – HuR (MOUSE) monoclonal antibody	Thermo Fisher Scientific	–	The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit  – 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti – α – tubulin (MOUSE) monoclonal antibody	Santa Cruz	8035	1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti – PARP (RABBIT) Polyclonal antibody	Cell Signaling	9542	1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti – Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody	Rockland	200-301-A87
Secondary goat anti-rabbit antibody	Cell Signaling	7074
Secondary rabbit anti-mouse antibody	Sigma-Aldrich	A-9044
RPMI – 1640 medium	Sigma-Aldrich	R8758
FBS – Filtrated Bovine Serum	Pan Biotech	P40-37500
Penicillin – streptomycin (100x)	Sigma-Aldrich	P4333
L-Glutamine solution (200 mM)	Sigma-Aldrich	G7513
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco by Life technologies	25200-056
Mini-PROTEAN 3 Cell	Bio-Rad	1653301
Mini Protean System Glass Plates	Bio-Rad	1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer	Bio-Rad	1653312
Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL	Bio-Rad	1653365
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules	Bio-Rad	1658050
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Rotiphorese gel 30 – aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1	Roth	3029
20% SDS	PanReac AppliChem	A3942
PVDF transfer membrane	Perkin Elmer	NEF1002	Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min
Trans-Blot SD semi-dry transfer cell	Bio-Rad	1703940
Clarity Western ECL Substrate	Bio-Rad	1705061
FusionFX  Digital Imager	Vilber	–
RNA oligo synthesis	Mycrosynth AG, Switzerland	–	the synthesis scale – 0.04 µmol – HPLC purified
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7030
Hydrochloric Acid (HCl) 6 M	PanReac AppliChem	182883.1211
Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5	Thermo Fisher Scientific	15567027
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	17904	50% sterile aliquots to be stored at -20°C
Pierce Streptavidin magnetic beads	Thermo Fisher Scientific	88817	Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 – 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process.
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Coomassie G-250	Applichem	A3480
Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate	Sigma-Aldrich	368458
ortho-phosphoric acid	Applichem	A0637