Homochronic Transplantation von Interneuron Vorstufen in frühen postnatalen Mäusegehirnen
Summary
Anspruchsvolle junge Neuronen im neuen Hirnregionen kann wichtige Erkenntnisse, wie die Umwelt neuronalen Schicksal und Reifung formt zu offenbaren. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Ernte Interneuron Vorstufen von bestimmten Gehirnregionen und verpflanzen sie entweder Homotopically oder heterotopically in das Gehirn des postnatalen Welpen.
Abstract
Neuronale Schicksal Entschlossenheit und Reifung erfordert ein kompliziertes Zusammenspiel zwischen genetischen Programme und Umweltsignale. Entwirrt die Rollen der intrinsische vs. extrinsische Mechanismen, die Regeln dieser Differenzierungsprozess ist jedoch ein Rätsel für alle Entwicklungsstörungen Neurobiologen. Dieses Problem wird für Gabaergen Interneuronen, ein unglaublich heterogene Zellpopulation vergrößert, die entsteht aus Transienten embryonale Strukturen und unterziehen eine langwierige wandernde Phase, während das Telencephalon zu zerstreuen. Wie verschiedene Gehirn Umgebungen beeinflussen Interneuron Schicksal und Reifung zu erkunden, haben wir ein Protokoll für die Ernte eindringmittel beschrifteten unreifen Interneuron Vorstufen von bestimmten Gehirnregionen bei Neugeborenen Mäusen (P0-P2) entwickelt. In diesem Alter konnte die Migration ist fast abgeschlossen und diese Zellen sind mit Wohnsitz in ihre letzte Ruhestätte Umgebungen mit relativ wenig synaptische Integration. Nach Sammlung von einzelligen Lösungen via Durchflusszytometrie sind diese Interneuron Vorstufen in P0-P2 Wildtyp postnatale Welpen transplantiert. Indem Sie beide Orbit durchführen (z. B. Cortex-Rinde) oder heterotopisch (z. B. Kortex, Hippocampus) Transplantationen, kann man beurteilen, wie unreife Interneuronen in neue Gehirn Umgebungen eine Herausforderung ihr Schicksal, Reifung und Schaltung Integration betrifft. Gehirn können bei Erwachsenen Mäusen geerntet und mit einer Vielzahl von Posthoc Analyse der transplantierten Zellen, einschließlich immunhistochemische, untersucht elektrophysiologische und transkriptionelle Profilierung. Dieses allgemeine Konzept bietet Ermittler mit einer Strategie, wie verschiedene Gehirn Umgebungen assay können zahlreiche Aspekte der Neuron Entwicklung zu beeinflussen und zu identifizieren, wenn neuronale Besonderheiten im Wesentlichen auf Hardwired genetische Programme zurückzuführen sind oder ökologische Hinweise.
Introduction
Kortikale Funktion erfordert ein Gleichgewicht zwischen erregenden Projektion Neuronen und inhibitorischen Gabaergen Interneuronen, einer extrem heterogenen Bevölkerung mit verschiedenen Morphologien, elektrophysiologischen Eigenschaften, Konnektivität und neurochemischen Marker. Abnorme Entwicklung und Funktion von Interneuronen (und spezifische Interneuron Untergruppen) hat in Verbindung gebracht worden, der Pathobiologie der psychiatrischen Erkrankungen wie Schizophrenie, Autismus und Epilepsie1,2,3. Darüber hinaus sind viele Gene, die an diesen Erkrankungen des Gehirns beteiligt in jungen Interneurone4stark angereichert. Daher ist ein größeres Verständnis für die Mechanismen, die Interneuron Schicksal Entschlossenheit und Reifung regulieren erforderlich, um die normale Entwicklung und mögliche Ursachen von zahlreichen Erkrankungen des Gehirns zu verstehen.
Vorderhirn Interneuronen entstehen in erster Linie aus zwei transient embryonale Strukturen, die medialen und kaudalen ganglionic Eminenzen (MGE und CGE, beziehungsweise). Diese postmitotischen Zellen (Interneuron Vorstufen) dann durchlaufen einen langwierigen tangential Migrationsphase während das Telencephalon zu zerstreuen, wo sie in einer Vielzahl von Schaltungen zu integrieren. MGE-abgeleitete Interneuronen bestehen aus drei weitgehend nicht überlappende, neurochemisch definierten Untergruppen: schnell Spick Parvalbumin (PV+) Interneurone, Spick Somatostatin (SST+) Interneurone, schnelle und spät Spick neuronale Stickstoffmonoxid Stickoxid-Synthase (Nngoo+) Interneuronen, die hippocampale Neurogliaform und Efeu Zellen darstellen. Zahlreiche Labors haben mehrere Mechanismen innerhalb der MGE identifiziert, die erste Schicksal Entscheidungen in PV+ oder SST + Interneuronen, einschließlich räumlichen Gradienten Morphogens, Geburtsdatum Interneuron Grundstoffe und den Modus der neurogenen Division zu regulieren 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. es wurde vorgeschlagen, dass Interneuronen zunächst in “Kardinal Klassen” zu unterscheiden und dann schrittweise in “endgültigen Klassen”, Reifen wie sie mit ihrer Umwelt11 interagieren. Den letzten deutet darauf hin, dass einige Reife Interneuron Subtypen genetisch veranlagt sein können, wie diese Zellen werden in die ganglionic Eminenzen postmitotischen darauf hinweist, dass frühe definierten intrinsischen genetische Programme eine größere Rolle als bisher spielen kann Geschätzte12,13. Die entscheidende Frage der Interaktion der intrinsischen genetische Programme mit Umwelt-Signale zu Laufwerk Differenzierung in unterschiedliche Interneuron Subtypen bleibt jedoch weitgehend unerforscht.
Zahlreiche Studien haben MGE Embryonalzellen direkt in eine Vielzahl von Hirnregionen, mit den Ergebnissen der Konsens verpflanzt, die verpflanzten Zellen Reifen und GABA um in der Regel die lokale endogene Schaltung14,15hemmen, 16,17,18,19. Diese vielversprechenden Beobachtungen haben großes Interesse im Umgang mit menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hIPSC) erzeugt-Interneurone zur Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen des Gehirns abgeleitet. Hält jedoch sehr wenige von diesen Studien beurteilen, ob diese transplantierten Zellen zu der erwarteten Typen von Reifen Interneuronen heranreifen, eine kritische Komponente, wenn man über translationale Ansätze.
Um zu beheben wie Umwelt Interneuron Differenzierung und Reifung beeinflusst, wurde eine Strategie entwickelt, um verpflanzen Interneuron unreife Vorstufen in neue Gehirn Umgebungen um zu prüfen, ob veredelte Interneuronen Funktionen des Hosts übernehmen Umwelt oder Funktionen aus dem Spender Umwelt20zu behalten. MGE-Transplantationen sind nicht geeignet, diese Frage ansprechen, denn die MGE enthält eine Mischpopulation Interneuron und Gabaergen Projektion Zellen, die in zahlreichen Gehirn Regionen21zu zerstreuen. Ohne zu wissen, wo diese Zellen MGE migriert haben würde, kann man nicht umfassend beurteilen, wie diese Transplantationen von Gehirn Umwelt betroffen sind. Durch das Ernten von Interneuron Vorläufer an frühen postnatalen Zeitpunkten, wird dieses Problem umgangen, indem unreifen Zellen, die ihre Migration abgeschlossen und ihr Ziel erreicht haben erhalten Region des Gehirns, sondern haben nur minimale Interaktion mit der Umwelt. Durch die Fokussierung auf Besonderheiten der Interneurone, die zwischen den unterschiedlichen Gehirnregionen differentiell exprimiert werden, kann man dann feststellen, wie die Host-Umgebung Interneuron Eigenschaften ändert. Der allgemeine Ansatz in diesem Protokoll sollten auf jeder Ermittler anwendbar sein, dass will untersuchen, wie die jungen Neuronen wann Verhalten in einer neuen Umgebung in Frage gestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein wichtiger Aspekt dieses Protokolls ist die Überlebensfähigkeit der Zellen zu maximieren. Um sicherzustellen, dass das Gewebe und die Zellen immer im eiskalten Carboxygenated sACSF sind ist notwendig zum Überleben der Zellen zu fördern. Dies erfordert eine effiziente Dissektion und Dissoziation Strategie die Länge der Zeit zu minimieren, die die Zellen in verschiedene Lösung und außerhalb der Gehirn-Umgebung zu verbringen. Abhängig von der Anzahl von Hirnregionen seziert und transplantiert wird kann es vorteil…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde unterstützt durch die National Institutes of Health (K99MH104595) und das NICHD intramural Research Program, T.J.P. Wir danken Gord Fishell, in dessen Labor dieser Ansatz ursprünglich gegründet wurde.
Materials
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Brain Matrices | Roboz | SA-2165 | Only needed if harvesting striatum |
| Fine point Dumont Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Microdissecting scissors | Roboz | RS-5940 | |
| Razor blades | ThermoFisher | 12-640 | |
| Pasteur pipettes | ThermoFisher | 1367820C | |
| Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
| Manual Manipulator w/ stand | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
| 5 ml round bottom plastic tubes | ThermoFisher | 149591A | |
| 60 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12556001 | |
| 100 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12565100 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
| DNase I | Sigma | 4716728001 | |
| Celltrics 50um filters | Sysmex | 04-0042327 | |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15-250-061 | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | 02-671-6 |
Referencias
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