Homochronic transplante de precursores interneurônio nos cérebros de Mouse pós-natal precoce
Summary
Desafio jovens neurônios em novas regiões do cérebro pode revelar importantes insights sobre como o ambiente esculpe, maturação e destino neuronal. Este protocolo descreve um procedimento para colheita precursores interneurônio de regiões específicas do cérebro e transplantá-las de qualquer homotopically ou heterotopically para o cérebro dos filhotes pós-natal.
Abstract
Maturação e determinação neuronal destino requer uma intrincada interação entre programas genéticos e sinais ambientais. No entanto, destrinçar os papéis de intrínseco versus extrínsecos mecanismos que regulam este processo de diferenciação é um enigma para todos os neurobiologists do desenvolvimento. Esta questão é ampliada para gabaérgica interneurônios, uma população celular incrivelmente heterogênea que nasce das estruturas embrionárias transitórias e passam por uma fase migratória prolongada para dispersar ao longo do telencéfalo. Para explorar diferentes como cérebro ambientes afetam interneurônio destino e maturação, desenvolvemos um protocolo para a colheita fluorescente etiquetadas interneurônio imaturo precursores de regiões específicas do cérebro em ratos recém-nascidos (P0-P2). Nesta idade, migração de interneurônio está quase completa e estas células são residentes em seus ambientes de descanso finais com relativamente pouca integração sináptica. Coleção de soluções de célula única via citometria de fluxo, na sequência destes precursores interneurônio são transplantados P0-P2 sua filhotes pós-natal. Através da realização de ambos homotopicamente (por exemplo, córtex-para-córtex) ou heterotópica (por exemplo, córtex-para-hipocampo) transplantes, pode avaliar como desafiador interneurônios imaturos em novos ambientes de cérebro afeta seu destino, maturação e integração do circuito. Cérebro pode ser colhido em ratos adultos e analisado com uma grande variedade de análises posthoc enxertados em células, incluindo a imuno-histoquímica, eletrofisiológicos e transcriptional de criação de perfil. Esta abordagem geral fornece investigadores com uma estratégia a ensaiar como distintos ambientes do cérebro podem influenciar numerosos aspectos do desenvolvimento do neurônio e identificar se especificidade neuronal é conduzida principalmente por programas genéticos hardwired ou Dicas ambientais.
Introduction
Função cortical adequada requer um equilíbrio entre neurônios de projeção excitatória e inibitória gabaérgica interneurônios, uma população extremamente heterogêneo com morfologias distintas, Propriedades eletrofisiológicas, conectividade e neuroquímicos marcadores. Desenvolvimento anormal e função de interneurônios (e subgrupos específicos interneurônio) tem sido associada com o Patobiológico de transtornos psiquiátricos como esquizofrenia, autismo e epilepsia1,2,3. Além disso, muitos genes implicados nestes distúrbios cerebrais são fortemente enriquecidos em interneurônios jovem4. Assim, uma maior compreensão dos mecanismos que regulam a maturação e interneurônio destino determinação é necessária para compreender o desenvolvimento normal e potenciais etiologias de numerosas doenças do cérebro.
Interneurônios prosencéfalo nascem principalmente a partir de duas estruturas embrionárias transitórias, as medial e caudais Eminências ganglionar (MGE e CGE, respectivamente). Estas células postmitotic (precursores de interneurônio) em seguida, passam por uma fase de migração tangencial prolongada para dispersar ao longo do telencéfalo onde eles integrarem uma grande variedade de circuitos. MGE-derivado interneurônios consistem em três subgrupos em grande parte não-sobreposição, neuroquimicamente definidos: rápido spiking interneurônios parvalbumin (PV+), não-fast spiking interneurônios somatostatina (SST+) e tarde cravação neuronal nítrico Interneurônios óxido de sintase (nNOS+) que constituem as células neurogliaform e ivy hippocampal. Numerosos laboratórios identificaram vários mecanismos dentro do MGE que regulam o destino inicial as decisões em PV+ ou SST + interneurônios, incluindo gradientes espaciais de morphogens, data de nascimento de precursores interneurônio e o modo de divisão neurogênica 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. tem sido proposto que interneurônios inicialmente diferenciarem em ‘classes cardeais’ e em seguida, progressivamente maduro em ‘classes definitivas’, como eles interagem com seu ambiente11. Provas recentes indicam que alguns subtipos de interneurônio maduro podem ser geneticamente hardwired como essas células se tornam postmitotic nas Eminências ganglionar, indicando que os programas genéticos intrínsecos definidos precoce podem desempenhar um papel maior do que anteriormente agradecido12,13. No entanto, a questão fundamental de como os programas genéticos intrínsecos interagem com pistas ambientais para diferenciação de unidade em subtipos distintos interneurônio permanece largamente inexplorada.
Numerosos estudos transplantamos células embrionárias MGE diretamente em uma variedade de regiões do cérebro, com os resultados de consenso que transplantaram células maduras e liberação de GABA para inibir geralmente o circuito endógeno local14,15, 16,17,18,19. Estas observações de prometendo geraram interesse significativo no uso de células-tronco pluripotentes induzidas humana (hIPSC)-derivado de interneurônios para tratar uma variedade de doenças do cérebro. No entanto, muito poucos desses estudos avaliar se estas células enxertadas maduro em tipos esperados dos interneurônios maduros, um componente crítico quando se pensa em abordagens translacionais.
Para resolver, como o ambiente influencia interneurônio diferenciação e maturação, uma estratégia foi concebida para transplante de precursores imaturos interneurônio em novos ambientes de cérebro a fim de examinar se enxertados interneurônios adotam características do host ambiente ou manter características do doador ambiente20. MGE transplantes não são adequados para abordar esta questão, porque o MGE contém uma população mista de interneurônio e células de projeção gabaérgica que dispersarem ao longo de inúmeras regiões de cérebro21. Sem saber onde estas células MGE que migraram, um pode não totalmente avaliar como esses transplantes são afetados pelo ambiente de cérebro. Por colheita precursores interneurônio no início pós-natal momentos, este problema é contornado pela obtenção de células imaturas que completou sua migração e atingiu sua meta região do cérebro, mas ter a mínima interação com o ambiente. Centrando-se em características específicas de interneurônios diferencialmente expressos entre regiões distintas do cérebro, pode então determinar como o ambiente de host muda Propriedades interneurônio. A abordagem geral descrita no presente protocolo deve ser aplicável para qualquer investigador que quer examinar os neurônios como jovens se comportam quando desafiado em um novo ambiente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um aspecto crítico deste protocolo é maximizar a capacidade de sobrevivência das células. Garantindo que os tecidos e as células são sempre em sACSF de carboxygenated fria como o gelo é necessário promover a sobrevivência da pilha. Isto requer uma dissecção eficiente e estratégia de dissociação para minimizar o comprimento de tempo que as células gastam em solução várias e fora do ambiente do cérebro. Dependendo do número de regiões do cérebro sendo dissecado e transplantados, pode ser útil ter um …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo National Institutes of Health (K99MH104595) e o programa de pesquisa intramural FORMULADORES para T.J.P. Agradecemos Gord Fishell, em cujo laboratório esta abordagem foi estabelecida originalmente.
Materials
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Brain Matrices | Roboz | SA-2165 | Only needed if harvesting striatum |
| Fine point Dumont Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Microdissecting scissors | Roboz | RS-5940 | |
| Razor blades | ThermoFisher | 12-640 | |
| Pasteur pipettes | ThermoFisher | 1367820C | |
| Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
| Manual Manipulator w/ stand | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
| 5 ml round bottom plastic tubes | ThermoFisher | 149591A | |
| 60 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12556001 | |
| 100 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12565100 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
| DNase I | Sigma | 4716728001 | |
| Celltrics 50um filters | Sysmex | 04-0042327 | |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15-250-061 | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | 02-671-6 |
Referencias
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