Ganganalyse leeftijd-afhankelijke Motor bijzondere waardeverminderingen in muizen met neurodegeneratie
Summary
In deze studie tonen wij het gebruik van kinematische ganganalyse, gebaseerd op het ventrale vliegtuig imaging als u wilt controleren de subtiele veranderingen in motorische coördinatie alsmede de progressie van neurodegeneratie met het bevorderen van leeftijd in muismodellen (bijvoorbeeld endophilin mutant muis lijnen).
Abstract
Motor probleem tests worden vaak gebruikt om te bepalen van de functionele relevantie van een knaagdier model en als u wilt testen nieuw ontwikkelde behandelingen in deze dieren. Specifiek, kunt ganganalyse troonsbestijging ziekte relevante fenotypen die worden waargenomen bij menselijke patiënten, vooral in neurodegeneratieve ziekten die invloed hebben op de motoriek zoals de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Alzheimer (AD), Amyotrofische laterale sclerose (ALS), en anderen. In vroege studies langs deze lijn, meting van gait parameters was moeizaam en afhankelijk van factoren die moeilijk te controleren waren (bijvoorbeeld rijsnelheid, continue werking). De ontwikkeling van ventrale vliegtuig beeldvormingssystemen (VPI) maakt het mogelijk uit te voeren ganganalyse op een grote schaal, waardoor deze methode een nuttig instrument voor de beoordeling van motor gedrag bij knaagdieren. Hier presenteren we een diepgaande protocol over het kinematische ganganalyse gebruik te onderzoeken van de progressie van de leeftijd afhankelijk van motorische tekorten in muismodellen van neurodegeneratie; muis lijnen met een verminderde mate van endophilin, waarin neurodegeneratieve schade geleidelijk met de leeftijd toeneemt, worden gebruikt als voorbeeld.
Introduction
Neurodegeneratieve ziekten voor patiënten, families en samenleving een belangrijke belasting vormen, en wordt nog zorgwekkender wanneer levensverwachting toeneemt, en de wereldbevolking blijft leeftijd. Een van de meest voorkomende symptomen van neurodegeneratieve ziekten zijn evenwicht en mobiliteit problemen. Dus, karakterisering van motor gedrag in veroudering zoogdieren (bijvoorbeeld knaagdier) modellen en/of modellen tonen neurodegeneratieve fenotypen, is een waardevol instrument om aan te tonen van de in vivo relevantie van de specifieke dierlijke model(len), of therapeutische behandelingen die gericht zijn op verbetering van de symptomen van de ziekte. Bijna elke aanpak bij de behandeling van neurodegeneratieve ziekten moeten uiteindelijk testen in een diermodel vóór aanvang van een klinische proef bij de mens. Daarom is het cruciaal om betrouwbare, reproduceerbare gedrag testen die kunnen worden gebruikt om consequent kwantificeren ziekte-relevante fenotypen langs leeftijd progressie, om ervoor te zorgen dat een kandidaat-drug, die potentieel in een in vitro model toonde, kan effectief verbeteren het fenotype in een levend dier.
Een aspect van motor gedrag beoordeling bij knaagdieren is kinematische ganganalyse, die kan worden uitgevoerd door VPI (ook genaamd ventrale vliegtuig videografie)1,2. Deze gevestigde methode speelt in op de ononderbroken registratie van de onderkant van de knaagdieren wandelen boven op een transparante en gemotoriseerde loopband riem1,2,3,4. Analyse van de video-feed van de gegevens maakt “digitale paw prints” van alle vier ledematen die dynamisch en betrouwbaar van het knaagdier wandelen patroon, zoals oorspronkelijk beschreven door Kale et al. recapituleren 2 en Amende et al. 3.
Het principe van imaging gebaseerde ganganalyse is voor het meten van het gebied van de poot in contact met de loopband gordel na verloop van tijd voor elke afzonderlijke poot. Elke houding wordt vertegenwoordigd door een toename van de poot gebied (in de remmen fase) en een afname van de poot gebied (in de fase van de voortstuwing). Dit wordt gevolgd door de fase van de swing waarin geen signaal wordt gevonden. Swing en houding samen vormen een stap. Naast gait dynamics parameters, kunnen houding parameters ook worden afgeleid uit de opgenomen video’s. Voorbeeldige parameters en de definitie ervan zijn vermeld in tabel 1 en omvatten houding breedte (SW; de gecombineerde afstand van de voorgrond of achterste poten aan de snuit-staart-as), paslengte (SL; gemiddelde afstand tussen de twee stappen van de dezelfde paw) of paw plaatsing hoek (de hoek van de poot op de snuit-staart-as). De houding en gait populatiedynamische gegevens toestaan van conclusies op dierlijke balans (door houding parameters en hun variabiliteit over verschillende stappen) en coördinatie (door gait dynamics parameters). Andere parameters, zoals ataxie coëfficiënt (de SL variabiliteit berekend door [(max. SL−min. SL) / bedoel SL]), hind-limb gedeeld standpunt tijd (die beide hind ledematen in contact met de riem zijn), of paw slepen (totale oppervlakte van de poot op de riem van volledige houding naar paw lift-off) kan ook worden geëxtraheerd, en zijn gemeld te worden gewijzigd in verschillende neurodegeneratieve di Sease5,6,7,8 modellen (Zie tabel 1).
| Met de parameter | Eenheid | Definitie |
| Swing time | MS | duur van die de poot niet in contact met de gordel is |
| houding tijd | MS | duur van die de poot in contact met de gordel is |
| % rem | % van houding tijd | percentage van de tijd van de houding van de poten zijn in de rem-fase |
| % voortbewegen | % van houding tijd | percentage van tijd van de houding van de poten zijn in de fase van de voortstuwing |
| breedte van de houding | cm | gecombineerde afstand van de voorgrond of achterste poten aan de snuit-staart-as |
| paslengte | cm | gemiddelde afstand tussen de twee stappen van de zelfde poot |
| pastempo | passen/s | aantal volledige stappen per seconde |
| Paw plaatsing hoek | DEG | hoek van de poot ten opzichte van de as van de snuit-staart van het dier |
| ataxie coëfficiënt | a.u. | SL variabiliteit berekend door [(max SL-min SL)/gemiddelde SL] |
| % gedeelde standpunt | % van houding | Hind-limb gedeeld standpunt tijd; tijd dat beide hind ledematen in contact met de riem op hetzelfde moment zijn |
| Paw slepen | mm2 | totale oppervlakte van de poot op de riem van volledige houding naar lift-off paw |
| ledemaat laden | cm2 | MAX dA/dT; maximale snelheid van verandering van paw gebied in de fase van het breken |
| stap hoek variabiliteit | DEG | standaarddeviatie van de hoek tussen de hind paws als een functie van SL en SW |
Tabel 1. Definitie van belangrijke gait parameters die kunnen worden getest door ventrale vliegtuig imaging.
Beoordeling van de motor gedrag van knaagdier modellen van neurodegeneratieve ziekten kan lastig zijn afhankelijk van de ernst van het fenotype van een specifiek model op een bepaalde leeftijd. Verschillende ziekten, meest prominent PD, Toon sterke motor gedrag (motoriek) tekorten, zowel bij patiënten als in diermodellen. Een van de vier belangrijkste symptomen bij PD is bradykinesia, die vordert met veroudering en manifesteert in ernstige gait bijzondere waardeverminderingen reeds in de vroege stadia van PD9. Onderzoek naar de acute PD model, knaagdieren die zijn behandeld met 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP), hebben al gebruik gemaakt van VPI gait analyse10,11,12. Echter, gezien de acute aard van dit model, deze studies niet ingegaan op de leeftijdsgebonden progressie van motorische tekorten. Verschillende recente studies hebben uitgevoerd ganganalyse in leeftijd muizen met neurodegeneratieve wijzigingen, bijvoorbeeld13,14,15, nadruk op het belang van inzicht in de progressie van de ziekte met het bevorderen van leeftijd .
Naast motorische tekorten, dierlijke modellen van neurodegeneratieve ziekten vaak moeite zich te concentreren op de taken van het onderzoek hebben en Toon van de prominente cognitieve beperkingen, met name met het bevorderen van de leeftijd. Dergelijke een fenotype kan invloed op het resultaat van motor gedrag tests. Namelijk, is één van de meest gebruikte tests te onderzoeken motor tekorten, de rotarod test16, afhankelijk van de cognitie, aandacht en stress17,18. Terwijl de bereidheid om te lopen op een gemotoriseerde loopband is ook afhankelijk van deze factoren, de opgenomen uitlezing wordt uitgevoerd, die een meer gestandaardiseerde functie is en veel minder beïnvloed door veranderde cognitie. Effecten van stress en aandacht kunnen worden zichtbaar in specifieke parameters, zoals de swing/houding tijd voor stress en SL voor aandacht19,20, maar niet in de algemene lopende vermogen.
De aanpak van de analyse van de kinematische gait verder biedt het voordeel van het hebben van opties om aan te passen de uitdaging voor knaagdieren modellen. De loopband met een instelbare hoek en snelheid kunt lopen snelheden van 0.1 – 99,9 cm/s, zodat knaagdieren met ernstige wandelen afboekingen kunnen nog wel draaien op een langzame snelheid (~ 10 cm/s). Niet-gehandicapte dieren kunnen worden gemeten op sneller uitgevoerd snelheden (30 – 40 cm/s). De waarneming van de geteste dieren zijn of of niet kundig voor stormloop bij een bepaalde snelheid levert een resultaat op zichzelf. Verder kan het knaagdier bovendien worden uitgedaagd om te draaien omhoog een helling of omlaag een daling, door het kantelen van de loopband een gewenste hoek met de hulp van een goniometer, of door het aanbrengen van een gewogen slee tot muis of rat hind ledematen.
Naast talrijke studies van één proteïnen toe die worden gemuteerd in patiënten, is er een recente bewustmaking van de verbanden tussen defecte endocytose proces en neurodegeneratie13,21,22, 23,24,25,26,27,28. Muis modellen met lagere niveaus van endophilin-A (voortaan endophilin), een belangrijke speler in de beide clathrin-gemedieerde endocytose13,21,29,30,31 , 32 , 33 , 45 en clathrin-onafhankelijke endocytose34, bleken neurodegeneratie en leeftijd-afhankelijke bijzondere waardeverminderingen in de motorische activiteit13,21weergeven. Drie genen coderen de familie van endophilin eiwitten: endophilin 1, endophilin 2, en 3 endophilin. Met name het fenotype als gevolg van de uitputting van de endophilin eiwitten varieert afhankelijk van het aantal endophilin genen13,21te missen. Terwijl de drievoudige knock-out (KO) van alle genen van de endophilin is slechts een paar uur na de geboorte, en muizen zonder beide endophilin 1 en 2, bloeien en sterven binnen 3 weken na de geboorte niet dodelijk, toont één KO voor elk van de drie endophilins geen voor de hand liggende fenotype voor getest voorwaarden21. Andere endophilin mutant genotypen Toon van verminderde levensduur en motor waardeverminderingen met toenemende leeftijd13te ontwikkelen. Bijvoorbeeld endophilin 1KO-2HT-3KO muizen display wandelen wijzigingen en motor coördinatieproblemen (zoals getest door kinematische ganganalyse en rotarod) al bij 3 maanden oud, terwijl hun nestgenoten, weergeven endophilin 1KO-2WT-3KO dieren, een aanzienlijke afname motorische coördinatie alleen op 15 maanden van leeftijd13. Als gevolg van de enorme verscheidenheid van fenotypen in deze modellen is het noodzakelijk om te identificeren en toe te passen van een test die een scala aan uitdagingen die overeenkomt met de motor van het dier en cognitie vaardigheden, evenals de leeftijd kan integreren. Hier, detail we de experimentele procedures die op het kinematische ganganalyse kapitaliseren te beoordelen van het ontstaan en de progressie van motor bijzondere waardeverminderingen in een muismodel waarin neurodegeneratieve veranderingen (dat wil zeggen, de endophilin-mutanten). Dit omvat gait parameters te meten op verschillende leeftijden en verschillende severities motoriek bijzondere waardeverminderingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bestuderen van de motorische coördinatie is een nuttige benadering in de karakterisering van modellen van neurodegeneratieve ziekten, met name voor ziekten zoals PD waarin motor coördinatie is zwaar getroffen. We kunnen met behulp van een analyse van de functionele test van kinematische gait, subtiele veranderingen in de gang van de dieren aan het begin van de problemen van de motoriek, of modellen identificeren met zwakke neurodegeneratie en dus relatief bescheiden fenotype. Gezien het brede scala van fenotypen in ver…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken dierlijke verzorgers van de ENI dier faciliteit voor hulp bij het fokken, en Dr. Nuno Raimundo voor nuttige commentaren op het manuscript. I.M. wordt ondersteund door de subsidies uit de Duitse Research Foundation (DFG) dwars door onderzoek in samenwerkingsverband SFB-889 (project A8) en SFB-1190 (project P02) en de Emmy Noether Young Investigator Award (1702/1). C.M.R. wordt ondersteund door de fellowship van de Göttingen Onderzoekschool voor Neurowetenschappen, biofysica en moleculaire Biosciences (GGNB).
Materials
| DigiGait | Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA | DigiGait Imager and Analysis Software are included with the hardware | |
| non-transparent blanket or dark cloth | cover the test chamber to reduce the animal's feeling of exposure/stress | ||
| balance | e.g. Satorius | balance with 0.1 g accuracy and a maximum load of at least 100 g | |
| red finger paint | e.g. Kreul or Staedtler | for increasing the contrast between paws and animal’s body | |
| small paint brush | soft brush to apply finger paint to the animal paws | ||
| diluted detergent | for cleaning | ||
| disinfectant, e.g. Meliseptol or 70% ethanol | e.g. B.Braun | for desinfection |
Referencias
- Clarke, K. A., Still, l. J. Gait analysis in the mouse. Physiology and Behavior. 66, 723-729 (1999).
- Kale, A., Amende, I., Meyer, G. P., Crabbe, J. C., Hampton, T. G. Ethanol’s effects on gait dynamics in mice investigated by ventral plane videography. Alcohol Clin Exp Res. 28 (2), 1839-1848 (2004).
- Amende, I., Kale, A., McCue, S., Glazier, S., Morgan, J. P., Hampton, T. Gait dynamics in mouse models of Parkinson’s disease and Huntington’s disease. J Neuroeng Rehabil. 25, 2-20 (2005).
- Herbin, M., Hackert, R., Gasc, J. P., Renous, S. Gait parameters of treadmill versus overground locomotion in mouse. Behavioural Brain Res. 181 (2), 173-179 (2007).
- Powell, E., Anch, A. M., Dyche, J., Bloom, C., Richtert, R. R. The splay angle: A new measure for assessing neuromuscular dysfunction in rats. Physiol Behav. 67 (5), 819-821 (1999).
- Blin, O., Ferrandez, A. M., Serratrice, G. Quantitative analysis of gait in Parkinson patients: increased variability of stride length. J Neurol Sci. 98 (1), 91-97 (1990).
- Švehlík, M. D., et al. Gait Analysis in Patients With Parkinson’s Disease Off Dopaminergic Therapy. Arch Phys Med Rehabil. 90 (11), 1880-1886 (2009).
- Roome, R. B., Vanderluit, J. L. Paw-dragging: a novel, sensitive analysis of the mouse cylinder test. J Vis Exp. (98), e52701 (2015).
- Roiz Rde, M., Cacho, E. W., Pazinatto, M. M., Reis, J. G., Cliquet, A., Barasnevicius-Quagliato, E. M. Gait analysis comparing Parkinson’s disease with healthy elderly subjects. Arg Neuropsiquiatr. 68 (1), 81-86 (2010).
- Wang, X. H., et al. Quantitative assessment of gait and neurochemical correlation in a classical murine model of Parkinson’s disease. BMC Neurosci. 13, 142 (2012).
- Lao, C. L., Kuo, Y. H., Hsieh, Y. T., Chen, J. C. Intranasal and subcutaneous administration of dopamine D3 receptor agonists functionally restores nigrostriatal dopamine in MPTP-treated mice. Neurotox Res. 24 (4), 523-531 (2013).
- Zhao, Q., Cai, D., Bai, Y. Selegiline rescues gait deficits and the loss of dopaminergic neurons in a subacute MPTP mouse model of Parkinson’s disease. Int J Mol Med. 32 (4), 883-891 (2013).
- Murdoch, J. D., et al. Endophilin-A deficiency induces the FoxO3a-Fbxo32 network in the brain and causes dysregulation of autophagy and the ubiquitin-proteasome system. Cell Rep. 17 (4), 1071-1086 (2016).
- Dai, M., et al. Progression of Behavioral and CNS Deficits in a Viable Murine Model of Chronic Neuronopathic Gaucher Disease. PLoS One. 11 (9), e0162367 (2016).
- Szalardy, L., et al. Lack of age-related clinical progression in PGC-1α-deficient mice – implications for mitochondrial encephalopathies. Behav Brain Res. , 272-281 (2016).
- Rustay, N. R., Wahlsten, D., Crabbe, J. C. Influence of task parameters on rotarod performance and sensitivity to ethanol in mice. Behavioural Brain Research. 141 (2), 237-249 (2003).
- Majdak, P., et al. A new mouse model of ADHD for medication development. Sci Rep. 6, 39472 (2016).
- Ishige, A., Sasaki, H., Tabira, T. Chronic stress impairs rotarod performance in rats: implications for depressive state. Comportamiento. (1-2), 79-84 (2002).
- Fukui, D., Kawakami, M., Matsumoto, T., Naiki, M. Stress enhances gait disturbance induced by lumbar disc degeneration in rat. European Spine Journal. 27 (1), 205-213 (2017).
- Stuart, S., Galna, B., Delicato, L. S., Lord, S., Rochester, L. Direct and indirect effects of attention and visual function on gait impairment in Parkinson’s disease: influence of task and turning. Eur J Neuroscience. 46 (1), 1703-1716 (2017).
- Milosevic, I., et al. Recruitment of endophilin to clathrin coated pit necks is required for efficient vesicle uncoating after fission. Neuron. 72 (4), 587-601 (2011).
- Shi, M., et al. Identification of glutathione S-transferase pi as a protein involved in Parkinson disease progression. Am. J. Pathol. 175 (1), 54-65 (2009).
- Arranz, A. M., et al. LRRK2 functions in synaptic vesicle endocytosis through a kinase-dependent mechanism. J. Cell Sci. 128, 541-552 (2015).
- Quadri, M., et al. Mutation in the SYNJ1 gene associated with autosomal recessive, early-onset Parkinsonism. Hum. Mutat. 34 (9), 1208-1215 (2013).
- Krebs, C. E., et al. The Sac1 domain of SYNJ1 identified mutated in a family with early-onset progressive Parkinsonism with generalized seizures. Hum. Mutat. 34 (9), 1200-1207 (2013).
- Edvardson, S., et al. A deleterious mutation in DNAJC6 encoding the neuronal-specific clathrin-uncoating co-chaperone auxilin, is associated with juvenile parkinsonism. PLoS ONE. 7 (5), e36458 (2012).
- Cao, M., Milosevic, I., Giovedi, S., De Camilli, P. Upregulation of parkin in endophilin mutant mice. J neurosci. 34 (49), 16544-16549 (2014).
- Cao, M., et al. Parkinson sac domain mutation in synaptojanin 1 impairs clathrin uncoating at synapses and triggers dystrophic changes in dopaminergic axons. Neuron. 93 (4), 882-896 (2017).
- Farsad, K., Ringstad, N., Takei, K., Floyd, S. R., Rose, K., De Camilli, P. Generation of high curvature membranes mediated by direct endophilin bilayer interactions. J. Cell Biol. 155, 193-200 (2001).
- Ringstad, N., Nemoto, Y., De Camilli, P. The SH3p4/Sh3p8/SH3p13 protein family: binding partners for synaptojanin and dynamin via a Grb2-like Src homology 3 domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (16), 8569-8574 (1997).
- Ringstad, N., et al. Endophilin/SH3p4 is required for the transition from early to late stages in clathrin-mediated synaptic vesicle endocytosis. Neuron. 24 (1), 143-154 (1999).
- Ringstad, N., Nemoto, Y., De Camilli, P. J. Differential expression of endophilin 1 and 2 dimers at central nervous system synapses. Biol. Chem. 276 (44), 40424-40430 (2001).
- Verstreken, P., et al. Endophilin mutations block clathrin-mediated endocytosis but not neurotransmitter release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
- Boucrot, E., et al. Endophilin marks and controls a clathrin-independent endocytic pathway. Nature. 517, 460-465 (2015).
- Takezawa, N., Mizuno, T., Seo, K., Kondo, M., Nakagawa, M. Gait disturbances related to dysfunction of the cerebral cortex and basal ganglia. Brain Nerve. 62 (11), 1193-1202 (2010).
- Wahlsten, D. . Mouse Behavioral Testing: How to Use Mice in Behavioral Neuroscience. , (2010).
- Guillot, T. S., Asress, S. A., Richardson, J. R., Glass, J. D., Miller, G. D. Treadmill Gait Analysis Does Not Detect Motor Deficits in Animal Models of Parkinson’s Disease or Amyotrophic Lateral Sclerosis. J Mot Behav. 40 (6), 568-577 (2008).
- Hampton, T. G., Amende, I. Treadmill gait analysis characterizes gait alterations in Parkinson’s disease and amyotrophic lateral sclerosis mouse models. J Mot Behav. 42 (1), 1-4 (2010).
- Glajch, K. E., Fleming, S. M., Surmeier, D. J., Osten, P. Sensorimotor assessment of the unilateral 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson’s disease. Behav Brain Res. 230 (2), 309-316 (2012).
- Takayanagi, N., et al. Pelvic axis-based gait analysis for ataxic mice. J Neurosci Methods. 219 (1), 162-168 (2013).
- Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson’s disease. Neurosci Lett. 584, 184-189 (2015).
- Geldenhuys, W. J., Guseman, T. L., Pienaar, I. S., Dluzen, D. E., Young, J. W. A novel biomechanical analysis of gait changes in the MPTP mouse model of Parkinson’s disease. PeerJ. 3, e1175 (2015).
- Baldwin, H. A., Koivula, P. P., Necarsulmer, J. C. Step Sequence is a Critical Gait Parameter of Unilateral 6-OHDA Parkinson’s Rat Models. Cell Transplant. 26 (4), 659-667 (2017).
- Carter, R. J., Morton, J., Dunnett, S. B. Motor coordination and balance in rodents. Curr Protoc Neurosci. , (2001).
- Milosevic, I. Revisiting the Role of Clathrin-Mediated Endocytosis in Synaptic Vesicle Recycling. Front Cell Neurosci. , (2018).
