Análisis de la marcha de deficiencias motoras dependientes de la edad en ratones con neurodegeneración
Summary
En este estudio, se demuestra el uso del análisis cinemático de la marcha en plano ventral de imágenes para monitorear los cambios sutiles en la coordinación motora, así como la progresión de la neurodegeneración con edad en modelos de ratón (por ejemplo, endophilin mutante avanzada base líneas de ratón).
Abstract
Pruebas de comportamiento motor se utilizan comúnmente para determinar la relevancia funcional de un modelo de roedor y probar recién desarrollado tratamientos en estos animales. Específicamente, el análisis de la marcha permiten recuperación enfermedad fenotipos relevantes que se observan en pacientes humanos, especialmente en las enfermedades neurodegenerativas que afectan a motor habilidades tales como la enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Alzheimer (EA), amiotrófica esclerosis lateral (ELA) entre otros. En los primeros estudios en esta línea, la medición de parámetros de marcha era laborioso y dependía de factores que eran difíciles de controlar (por ejemplo, velocidad, corriente funcionamiento continuo). El desarrollo de sistemas de representación (VPI) en plano ventral hecho factible para realizar el análisis de la marcha a gran escala, haciendo este método una herramienta útil para la evaluación de la conducta motora en roedores. Aquí, presentamos un protocolo detallado de cómo utilizar el análisis de la cinemática de la marcha para examinar la progresión depende de la edad del déficit motor en modelos de ratón de la neurodegeneración; líneas de ratón con disminución de los niveles de endophilin, que daños neurodegenerativos aumenta progresivamente con la edad, se utilizan como ejemplo.
Introduction
Enfermedades neurodegenerativas imponen una carga significativa en los pacientes, las familias y la sociedad y se convertirá en motivo de preocupación aún mayor conforme aumenta la esperanza de vida, y la población mundial sigue a la edad. Uno de los síntomas más comunes de las enfermedades neurodegenerativas son problemas de equilibrio y movilidad. Así, la caracterización del comportamiento motor en envejecimiento mamífero (p. ej., roedores) modelos o modelos que muestran fenotipos neurodegenerativas, es una herramienta valiosa para demostrar la importancia de en vivo del modelo animal específico, o terapéutico tratamientos que tienen como objetivo mejorar los síntomas de la enfermedad. Casi cada enfoque para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, en definitiva, requiere pruebas en un modelo animal antes de la iniciación de un ensayo clínico en seres humanos. Por lo tanto, es fundamental contar con pruebas de comportamiento fiable y reproducible que pueden utilizarse para cuantificar sistemáticamente enfermedades relevantes fenotipos a lo largo de la progresión de la edad, con el fin de asegurar que un fármaco candidato que demostró el potencial en un modelo en vitro , puede efectivamente mejorar el fenotipo de un animal vivo.
Un aspecto de la evaluación de la conducta motora en roedores es análisis cinemático de la marcha, que se puede realizar por VPI (también llamado plano ventral videografía)1,2. Este método establecido capitaliza el registro continuo de la parte inferior de los roedores caminando sobre una cinta transparente y motorizado correa1,2,3,4. Análisis del vídeo datos crea “impresiones de la pata digital” de los cuatro miembros que dinámicamente y confiablemente recapitulan patrón de caminar de roedor, originalmente descrito por Kale et al. 2 y Amende et al. 3.
El principio de análisis basado en la proyección de imagen del paso es medir el área de la pata en contacto con la correa de la cinta de correr con el tiempo, para cada pata individual. Cada postura está representada por un aumento en el área de la pata (en la fase de frenado) y una disminución en el área de la pata (en la fase de propulsión). Esto es seguido por la fase en que se detecte ninguna señal. Swing y postura junto forman un paso. Además de parámetros de la dinámica de marcha, parámetros de postura pueden extraerse también de los vídeos grabados. Parámetros de ejemplares y su definición se enumeran en la tabla 1 incluyen postura anchura (SW; la distancia combinada de las patas delanteras o traseras al eje de la cola de hocico), paso largo (SL; la distancia media entre dos pasos de la misma pata) y colocación de la pata ángulo (el ángulo de la pata al eje de la cola de hocico). Los datos de dinámica de la postura y marcha permiten establecer conclusiones de dibujos sobre equilibrio animal (por parámetros de postura y su variabilidad sobre varios pasos) y coordinación (por parámetros de dinámica de marcha). Otros parámetros, tales como coeficiente de ataxia (la variabilidad del SL calculada por [(max. SL−min. SL) significa SL /]), extremidades comparten posición tiempo (que ambos miembros posteriores están en contacto con la correa), o arrastrar la pata (área total de la pata de la correa de posición completo a despegue de la pata) también puede ser extraído y se han divulgado para cambiar en varios neurodegenerative di Sease modelos5,6,7,8 (ver tabla 1).
| Parámetro | Unidad | Definición |
| tiempo de oscilación | MS | duración de tiempo que la pata no está en contacto con la correa |
| tiempo de postura | MS | duración de tiempo que la pata esté en contacto con la correa |
| freno de % | % de tiempo de postura | porcentaje del tiempo de postura de las patas son en la fase de freno |
| propulsar a % | % de tiempo de postura | porcentaje del tiempo de postura de las patas son en la fase de propulsión |
| anchura de la postura | cm | distancia combinada de las patas delanteras o traseras al eje de la cola de hocico |
| longitud de zancada | cm | distancia media entre dos pasos de la misma pata |
| frecuencia de zancada | avances/s | número de pasos completos por segundo |
| ángulo de colocación de la pata | DEG | ángulo de la pata en relación con el eje de cola del hocico del animal |
| coeficiente de ataxia | a.u. | Variabilidad SL calculado por [(max SL-min SL) Media SL] |
| % posición compartida | % de postura | tiempo de postura de extremidades compartido; momento en que ambos miembros posteriores están en contacto con la correa al mismo tiempo |
| pata de arrastre | mm2 | área total de la pata de la correa de posición completo a despegue de la pata |
| carga de la extremidad | cm2 | MÁXIMO dA/dT; máxima tasa de cambio de zona de la pata en la fase de ruptura |
| variabilidad del ángulo de paso | DEG | desviación del ángulo entre las traseras de las patas como una función del SL y SW |
Tabla 1. Definición de parámetros clave de paso que puede probar mediante la proyección de imagen de plano ventral.
Evaluar el comportamiento motor de los modelos de roedores para enfermedades neurodegenerativas puede ser difícil dependiendo de la severidad del fenotipo de un modelo específico a una determinada edad. Varias enfermedades, principalmente paladio, mostrar comportamiento motor fuerte (locomoción) los déficits, tanto en pacientes como en modelos animales. Uno de los cuatro síntomas fundamentales en la EP es la bradicinesia, que progresa con la edad y se manifiesta en deficiencias severas de la marcha ya en etapas tempranas de PD9. Estudios del modelo PD agudo, roedores tratados con 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP), han utilizado VPI gait análisis10,11,12. Sin embargo, dada la naturaleza aguda de este modelo, estos estudios no abordan la relacionada con la edad la progresión del déficit motor. Varios estudios recientes han llevado a cabo análisis de la marcha en ratones envejecidos con cambios neurodegenerativos, por ejemplo13,14,15, haciendo hincapié en la importancia de entender la progresión de la enfermedad con edad avanzada .
Además de déficit motor, modelos animales de enfermedades neurodegenerativas a menudo tienen dificultades para centrarse en las tareas de examen y mostrar las debilitaciones cognoscitivas prominentes, en particular con edad avanzada. Tal un fenotipo puede influir en el resultado de las pruebas de comportamiento motor. Es decir, una de las pruebas más utilizadas para examinar el déficit motor, el ensayo rotarod16, depende de la cognición, la atención y tensión17,18. Mientras que la voluntad de caminar en una caminadora motorizada también depende de estos factores, la lectura grabada está en marcha, que es una característica más estandarizada y mucho menos influenciada por cognición alterada. Efectos del estrés y atención pueden ser visibles en parámetros específicos, como el tiempo de oscilación/postura para el estrés y SL para atención19,20, pero no en capacidad de funcionamiento general.
El enfoque de análisis cinemático de la marcha además ofrece la ventaja de tener opciones para ajustar el desafío para los modelos de roedores. La caminadora con ángulo ajustable y velocidad permite a poca velocidad de 0.1 – 99,9 cm/s, para que los roedores con graves impedimentos a pie todavía pueden ser capaces de correr a una velocidad lenta (~ 10 cm/s). Animales con problemas no pueden medirse en correr más rápido velocidades (30 – 40 cm/s). La observación de los animales probados son capaces de correr a cierta velocidad si o no proporciona un resultado por sí mismo. Además, el roedor puede ser impugnado además correr hacia arriba en una pendiente, o por una caída, inclinando la cinta a un ángulo deseado con la ayuda de un goniómetro, o colocando un trineo cargado para extremidades traseras de ratón o rata.
Además de numerosos estudios de proteínas individuales que están mutados en los pacientes, existe una conciencia cada vez más recientes de los vínculos entre la defectuosa endocitosis proceso y neurodegeneración13,21,22, 23,24,25,26,27,28. Modelos con niveles reducidos de endophilin-A del ratón (en lo sucesivo endophilin), un jugador clave en ambos endocitosis mediada por clatrina13,21,,29,30,31 , 32 , 33 , se encontraron 45 y endocytosis clathrin-independiente34, para mostrar la neurodegeneración y el deterioro depende de la edad en actividad locomotor13,21. Tres genes que codifican la familia de proteínas endophilin: endophilin 1, endophilin 2 y endophilin 3. En particular, el fenotipo resultante del agotamiento de endophilin proteínas varía grandemente dependiendo del número de desaparecidos endophilin genes13,21. Mientras triple knock-out (KO) de todos los genes endophilin es mortal sólo unas horas después de nacer y los ratones sin tanto endophilin 1 y 2 no crecen y mueren dentro de 3 semanas después del nacimiento, KO solo para cualquiera de los tres endophilins no muestra ningún fenotipo obvio probado condiciones21. Otros genotipos mutantes endophilin muestran reducida vida útil y desarrollan deficiencias motoras con el aumento de edad13. Por ejemplo, endophilin 1KO-2HT-3KO ratones pantalla poca alteraciones y problemas de coordinación motora (como prueba rotarod y el análisis de la cinemática de la marcha) ya a los 3 meses de edad, mientras que sus hermanos de camada, endophilin 1KO-2WT-3KO animales, mostrar un significativo reducción en coordinación motora sólo a los 15 meses de edad13. Debido a la gran diversidad de fenotipos en estos modelos, es necesario identificar y aplicar una prueba que permite integrar una variedad de desafíos correspondiente al motor del animal y capacidades de cognición, así como la edad. Aquí detallamos los procedimientos experimentales que capitalizan el análisis cinemático de la marcha para evaluar la aparición y progresión de las deficiencias motoras en un modelo de ratón que muestra cambios neurodegenerativos (es decir, mutantes de endophilin). Esto incluye la medición de parámetros de marcha en distintas edades y diferentes niveles de gravedad de discapacidades de la locomoción.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estudiar la coordinación motora es un enfoque útil en la caracterización de modelos de enfermedades neurodegenerativas, especialmente para enfermedades como el PD que coordinación motora es severamente afectado. Con la ayuda de un análisis funcional del análisis cinemático de la marcha, podemos identificar cambios sutiles en el andar de los animales en el inicio de problemas de locomoción, o en modelos de neurodegeneración débil y por lo tanto relativamente modesto fenotipo. Dada la amplia gama de fenotipos en …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a cuidadores de animales en el Animalario de la ENI para ayuda con la crianza y el Dr. Nuno Raimundo útiles comentarios sobre el manuscrito. I.M. es apoyado por las becas de la Fundación de investigación alemana (DFG) a través del centro de investigación colaborativa SFB-889 (proyecto A8) y SFB-1190 (proyecto P02) y el premio al investigador joven Emmy Noether (1702/1). C.M.R. es apoyado por la beca de la escuela de postgrado de Göttingen para Neurociencias y Biofísica Molecular Biosciences (GGNB).
Materials
| DigiGait | Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA | DigiGait Imager and Analysis Software are included with the hardware | |
| non-transparent blanket or dark cloth | cover the test chamber to reduce the animal's feeling of exposure/stress | ||
| balance | e.g. Satorius | balance with 0.1 g accuracy and a maximum load of at least 100 g | |
| red finger paint | e.g. Kreul or Staedtler | for increasing the contrast between paws and animal’s body | |
| small paint brush | soft brush to apply finger paint to the animal paws | ||
| diluted detergent | for cleaning | ||
| disinfectant, e.g. Meliseptol or 70% ethanol | e.g. B.Braun | for desinfection |
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