Définition d’activité réglementée Redox chaperon de Hsp33 et de cartographie des changements conformationnels sur Hsp33 à l’aide de la spectrométrie de masse d’hydrogène deutérium Exchange
Summary
Une des conditions de stress plus difficiles que les organismes se rencontrent au cours de leur vie implique l’accumulation d’oxydants. Au cours du stress oxydatif, cellules s’appuient fortement sur chaperons moléculaires. Nous présentons ici les méthodes utilisées pour enquêter sur l’oxydo-réduction-anti-agrégation activité réglementée, aussi bien quant à surveiller les changements structurels régissant la fonction d’accompagnateur à l’aide de HDX-MS.
Abstract
Les organismes vivants doivent régulièrement faire face aux environnements fluctuantes au cours de leur cycle de vie, y compris les changements dans la température, le pH, l’accumulation des espèces réactives de l’oxygène et plus. Ces fluctuations peuvent conduire à une protéine généralisée qui se déroulent, agrégation et la mort des cellules. Par conséquent, les cellules ont évolué un réseau dynamique et contraintes spécifiques des chaperons moléculaires, qui maintiennent un proteome « sain » dans des conditions de stress. ATP-indépendante accompagnateurs constituent une classe importante de chaperons moléculaires, qui servent de molécules de défense de première ligne, protégeant contre l’agrégation des protéines en fonction de la contrainte. Une caractéristique de que ces chaperons ont en commun est leur capacité à utiliser la plasticité structurelle pour leur activation des contraintes spécifiques, la reconnaissance et la version du client mal repliée.
Dans cet article, nous nous concentrons sur l’analyse fonctionnelle et structurelle d’une telle escorte intrinsèquement désordonné, la Hsp33 bactérienne réglementées par oxydo-réduction, qui protège les protéines contre l’agrégation pendant le stress oxydatif. Nous présentons ici une panoplie de diverses techniques pour étudier l’activité chaperon redox réglementés, ainsi que pour la cartographie des changements de conformation de l’escorte, qui sous-tendent son activité. Plus précisément, les auteurs décrivent un flux de travail qui comprend la préparation des protéines entièrement réduites et entièrement oxydés, suivie d’une analyse du Chaperon anti-agrégation activité in vitro à l’aide de la dispersion de la lumière, en se concentrant sur le degré de la l’activité anti-agrégation et sa cinétique. Pour surmonter les fréquentes observations aberrantes accumulés au cours des épreuves de l’agrégation, les auteurs décrivent l’utilisation de Kfits, un nouvel outil graphique qui permet de traiter facilement des mesures cinétiques. Cet outil peut être facilement appliqué à d’autres types de mesures cinétiques pour enlever les valeurs aberrantes et des paramètres cinétiques d’ajustement. Pour établir une corrélation entre la fonction avec la structure de la protéine, nous décrivons l’installation et le flux de travail d’une technique de spectrométrie de masse structurelle, spectrométrie de masse échange hydrogène-deutérium, qui permet la cartographie des changements conformationnels sur l’escorte et substrat au cours des différentes étapes de l’activité Hsp33. La même méthode peut être appliquée aux autres interactions protéine-protéine et protéine-ligand.
Introduction
Cellules rencontrent fréquemment une accumulation des espèces réactives de l’oxygène (ROS) produites comme sous-produits de la respiration1,2, protéine et lipide oxydation3,4et processus supplémentaires5, 6,7. Malgré le rôle bénéfique de ROS’ dans divers processus biologiques comme la8,9 et réponse immunitaire10de signalisation cellulaire, un déséquilibre entre la production de ROS et sa désintoxication peut survenir, entraînant oxydatif insister sur7. Les cibles biologiques de ROS sont des protéines, des lipides et des acides nucléiques, l’oxydation qui influent sur leur structure et leur fonction. Par conséquent, l’accumulation d’oxydants cellulaires est fortement liée à un large éventail de pathologies dont le cancer9,11, inflammation12,13et vieillissement14, 15et ont été trouvés à être impliqués dans l’apparition et la progression des maladies neurodégénératives telles que de Alzheimer, Parkinson et ALS maladie16,17,18.
Protéines nouvellement synthétisées et matures sont très sensibles à l’oxydation en raison des modifications potentiellement nocifs de leurs chaînes latérales, qui façonnent la protéine structure et la fonction19,20. Par conséquent, le stress oxydatif conduit généralement à une inactivation de la protéine généralisée, le mauvais repliement et l’agrégation, aboutissant à la mort cellulaire. Une des stratégies pour faire face aux dommages potentiels d’oxydation des protéines cellulaires élégantes consiste à utiliser des chaperons redox-dépendante, qui inhibent l’agrégation des protéines généralisée, au lieu de former des complexes stables avec des protéines mal repliées client21 ,22,23. Ces chaperons de défense de première ligne sont rapidement activés par une oxydation in site (habituellement sur les résidus de cystéine) qui les convertit en des molécules anti-agrégation puissant24. Étant donné que le stress oxydatif se traduit par l’inhibition de la respiration et en baisse dans les cellulaires ATP niveaux25, canoniques chaperons dépendant de l’ATP sont moins efficaces pendant le stress oxydatif des conditions25,26 ,27. Par conséquent, activés par oxydo-réduction des chaperons ATP-indépendante jouent un rôle vital dans le maintien de l’homéostasie de protéine sur l’accumulation d’oxydants dans des bactéries et des eucaryotes (par exemple, Hsp3328 et RidA29 chez les bactéries, Get330 chez la levure, peroxiredoxins31 chez les eucaryotes). L’activité de ces chaperons dépend fortement des changements conformationnels structurelles réversibles induites par une oxydation in site qui dévoile les régions hydrophobes impliqués dans la reconnaissance des protéines mal repliées client.
Recherche du mécanisme anti-agrégation et les principes régissant la reconnaissance des protéines client par des accompagnateurs n’est pas facile en raison de la nature dynamique et hétérogènes de chaperon-substrat interactions32,33, 34,35,36,37. Cependant, chaperons stress réglementés ont la possibilité de faire progresser notre compréhension de la fonction anti-d’agrégation en raison de leur capacité à : 1) obtenir deux formes différentes de l’escorte, active (p. ex., oxydé) et inactifs (par exemple, réduite), avec l’introduction ou la suppression d’une condition de stress facilement basculer entre eux (par exemple, oxydant et réducteur), 2) ont un large éventail de substrats, 3) forment des complexes extrêmement stables avec les protéines de client qui peuvent être évaluées par différentes méthodes structurelles et 4) se concentrent uniquement sur la reconnaissance du substrat et de la libération, médiée par les changements conformationnels rédox dépendants, comme la majorité de ces chaperons n’a pas la capacité de pliage.
Ici, nous analysons l’activité bactérienne réglementés redox chaperon de Hsp33 anti-agrégation, une composante essentielle du système de défense bactérienne contre l’oxydation induite par la protéine agrégation28. Lorsque réduit, Hsp33 est une protéine liant le zinc étroitement pliée sans activité chaperon ; Toutefois, lorsqu’il est exposé au stress oxydatif, Hsp33 subit des changements de conformation qui exposent son substrat liaison régions38,39. Lors de l’oxydation, l’ion de zinc qui est fortement liée aux quatre résidus cystéine hautement conservée du domaine C-terminal est libéré40. Cela se traduit par la formation de deux ponts disulfures, un déroulement du domaine C-terminal et une déstabilisation de la région de linker adjacentes41. Les régions C-terminale et linker sont très flexibles et sont définies comme étant intrinsèquement ou partiellement désordonné. Retour aux conditions de non stress, les cystéines étant réduits et l’escorte revient à son état natif plié sans activité anti-agrégation. Le repliement de l’escorte mène à un déroulement plus loin et de déstabilisation de la protéine client lié, ce qui déclenche son transfert vers le système canonique chaperon, DnaK/J, pour le repliement38. Analyse des sites d’interaction de Hsp33 suggère que Hsp33 utilise les deux que sa charge désordonné régions ainsi que les régions hydrophobes sur l’éditeur de liens et le domaine N-terminal pour capturer pliée protéines client et empêche leur agrégation38, 42. dans l’État replié, ces régions sont masquées par le linker plié et un domaine C-terminal. Fait intéressant, la région sert comme un gardien d’état inactif et plissé de Hsp33, « sentir » le statut pliant de son côté du domaine C-terminal34. Une fois déstabilisés par mutagenèse (que ce soit par une mutation ponctuelle ou une perturbation de la séquence complète), Hsp33 est converti en un chaperon constitutivement actif quelle que soit l’état redox de ses cystéines d’oxydo-réduction sensible43.
Les protocoles présentés ici permettent de suivi d’activité Chaperon d’oxydo-réduction dépendant de Hsp33, ainsi que des changements conformationnels cartographie lors de l’activation et la liaison de protéines de client. Cette méthodologie peut être adaptée à la recherche d’autres modèles de reconnaissance d’escorte-client ainsi que les interactions protéine-protéine non-chaperon. Par ailleurs, nous présentons des protocoles pour l’établissement des chaperons entièrement réduits et oxydés qui peut être utilisé dans les études d’autres protéines redox-interrupteur, pour révéler le rôle potentiel de l’oxydation des protéines sur l’activité de la protéine.
Plus précisément, nous décrivons une procédure pour surveiller chaperon activité in vitro et définir sa spécificité de substrat sous différents types d’agrégation de protéines (chimiquement ou thermiquement induite) à l’aide de la diffraction de la lumière (LS) mesurée par un fluorospectromètre44. Au cours de l’agrégation, la lumière diffusion à 360 nm augmente rapidement en raison de la turbidité croissante. Ainsi, l’agrégation peut être surveillée de façon dépendante du temps à cette longueur d’onde. LS est une méthode rapide et sensible pour les tests d’agrégation des protéines et donc l’activité anti-agrégation d’une protéine d’intérêt en utilisant des concentrations nanomolaires, permettant la caractérisation des protéines liées à l’agrégation paramètres cinétiques sous différents conditions. En outre, le protocole de LS décrit ici ne nécessite pas d’instrumentation coûteuse et peut être facilement établi dans n’importe quel laboratoire.
Néanmoins, il est assez difficile d’obtenir des courbes cinétique « propre » et de dériver les paramètres cinétiques de la protéine de ce expériences, en raison de bruit et le grand nombre de valeurs extrêmes générées par les bulles d’air et les grands agrégats de diffusion de la lumière. Pour surmonter cet obstacle, nous présentons un nouvel outil graphique, Kfits45, utilisé pour réduire les niveaux de bruit dans les mesures cinétiques différentes, spécialement équipés pour les données cinétiques d’agrégation de protéines. Ce logiciel fournit des paramètres cinétiques préliminaires pour une évaluation rapide des résultats et permet à l’utilisateur de « nettoyer » de grandes quantités de données rapidement sans affecter ses propriétés cinétiques. Kfits est mis en œuvre en Python et disponible en open source à 45.
Une des questions difficiles sur le terrain se rapporte à la cartographie des sites d’interaction entre les chaperons et les protéines de leur client et de comprendre comment les chaperons reconnaissent un large éventail de substrats mal repliées. Cette question est encore compliquée lorsque l’étude des complexes de protéine très dynamique qui comportent intrinsèquement désordonnés chaperons et substrats sujettes à l’agrégation. Heureusement, la spectrométrie de masse structurelle a considérablement progressé ces dix dernières années et a fourni avec succès des approches utiles et des outils pour analyser la plasticité structurelle et cartographier les résidus impliqués dans la reconnaissance de protéines46, 47 , 48 , 49. nous présentons ici un tel échange hydrogène-deutérium en technique de spectrométrie de masse (HDX-MS)-qui permet la cartographie des modifications au niveau des résidus dans une conformation structurale à la modification de la protéine ou protéine/Ligand binding35, 50,51,52,53,,du5455. HDX-MS utilise l’échange continu d’hydrogènes de l’épine dorsale de deutérium, dont le taux est affecté par l’environnement chimique, accessibilité, et covalentes et non covalentes56. HDX-MS suit ces processus exchange à l’aide d’un solvant deutéré, généralement de l’eau lourde (D2O) et permet une mesure basée sur le changement de poids moléculaire après l’hydrogène à échange de deutérium. Un taux plus lent de l’échange hydrogène-deutérium peut résulter d’hydrogènes participent aux liaisons hydrogènes ou, simplement, à partir d’encombrement stérique, ce qui indique les variations locales de la structure,57. Modifications sur une liaison de ligand ou modifications post-traductionnelles peuvent aussi conduire à des différences dans l’environnement de l’hydrogène, avec une liaison résultant des différences quant à l’hydrogène-deutérium échange (HDX) Tarifs46,53.
Nous avons appliqué cette technique aux régions 1) carte Hsp33 qui rapidement se déroulent lors de l’oxydation, conduisant à l’activation de Hsp33 et 2) définissent l’interface de liaison potentielle de Hsp33 avec son substrat mal repliée pleine longueur, la citrate synthase (CS)38.
Les méthodes décrites dans ce manuscrit peuvent être appliquées à l’étude des fonctions spécifiques à une oxydo-réduction des protéines in vitro, définissant l’activité anti-agrégation et le rôle des changements structurels (le cas échéant) en fonction de la protéine. Ces méthodes peuvent être facilement adaptés aux divers systèmes biologiques et appliqués en laboratoire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, nous avons fourni des protocoles pour l’analyse de l’activité Chaperon d’oxydo-réduction-dépendante et la caractérisation des changements structurels sur la liaison d’une protéine de client. Ce sont des méthodes complémentaires pour définir les potentiels complexes chaperon-substrat et analyser des sites potentiels d’interaction.
Ici, nous avons appliqué ces protocoles pour la caractérisation d’un complexe entre l’escorte d’oxydo-réduction réglemen…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs sont reconnaissants au Meytal Radzinski pour ses discussions utiles et critique de lecture de l’article et à Patrick Griffin et les membres de son laboratoire pour leur assistance illimitée tout en établissant la plateforme d’analyse HDX. Les auteurs sont reconnaissants à la Fondation allemande-Israël (I-2332-1149.9/2012), la Fondation binationale de la Science (2015056), la subvention d’intégration Marie-Curie (618806), la Fondation des sciences Israël (1765/13 et 2629/16) et le Human Frontier Science Programme (CDA00064/2014) pour leur soutien financier.
Materials
| Chemicals, Reagents | |||
| Acetonitrile HPLC plus | Sigma Aldrich | 34998-2.5L | solvent |
| Formic acid Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A117-50 | solvent supplement |
| Isopropyl alcohol, HPLC grade | Fisher Chemicals | P750717 | solvent |
| Methanol | Fisher Chemicals | A456-212 | solvent |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | buffer |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 76-05-1 | solvent |
| Water for HPLC | Sigma Aldrich | 270733-2.5L-M | solvent |
| ZnCl2, Zinc Chloride | Merck | B0755416 308 | reagent |
| DTT | goldbio | 27565-41-9 | reducing agent |
| PD mini trap G-25 columns GE healthcare | GE healthcare | 29-9180-07 | desalting column |
| Potassium Phosphate | United states Biochemical Corporation | 20274 | buffer |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | K46809910526 | oxidizing agent |
| citrate synthase | sigma aldrich | C3260 | substrate |
| HEPES acid free | sigma aldrich | 7365-45-9 | buffer |
| Gndcl | sigma aldrich | G3272-500G | denaturant |
| Deuterium Chloride Solution | sigma aldrich | 543047-10G | buffer |
| Deuterium Oxide 99% | sigma aldrich | 151882-100G | solvent |
| TCEP | bioworld | 42000058-2 | reducing agent |
| 150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mm | La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific | ||
| 1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm | La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific | ||
| quartz cuvette | Hellma 101-QS | ||
| Instruments | |||
| Jasco FP-8500 Fluorospectrometer | Jasco | ||
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 13058/0 | |
| Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge | Thermo Scientific | ||
| pH meter , PB-11 sartorius | Sartorius | 13119/0 | |
| AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter). | AffiPro | ||
| Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) | Waters | ||
| C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm) | |||
| Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door | COY | ||
| Q-exactive-orbitrap mass spectrometer | Thermo-Fischer Scientific | ||
| PAL system LHX – robotic system for handling HDX samples | PAL system | https://www.palsystem.com/index.php?id=840 | |
| Dionex Ultimate 3000, XRS pump | Thermo Scientific | ||
| Dionex AXP-MS auxiliary pump | Thermo Scientific | ||
| Software, Software Tools, Database search | |||
| Kfits: Fit aggregation Data | http://kfits.reichmannlab.com/fitter/ | ||
| Thermo Scientific Xcalibur software | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487 | ||
| Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) | https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf | ||
| Chronos software (Axel Semrau) | http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html | ||
| Proteome Discoverer V1.4 software | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795 | ||
| HDX workbench software | http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html | ||
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