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Bioquímica

Definição da atividade de chaperona regulada por redox de Hsp33 e mapeamento de alterações conformacionais em Hsp33 usando espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério

Published: June 07, 2018
doi:
10.3791/57806
, , ,
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Safra Campus Givat Ram,The Hebrew University of Jerusalem

Summary

Dentre as mais adversas condições de stress que organismos encontram durante seu ciclo de vida envolve o acúmulo de oxidantes. Durante o estresse oxidativo, células dependem fortemente de chaperones moleculares. Aqui, apresentamos os métodos usados para investigar redox-regulado antiatividade agregação, bem como para acompanhar mudanças estruturais que regulam a função de acompanhante usando HDX-MS.

Abstract

Organismos vivos, regularmente, precisa lidar com ambientes de flutuação durante o seu ciclo de vida, incluindo mudanças de temperatura, pH, o acúmulo de espécies reativas de oxigênio e muito mais. Estas flutuações podem levar a uma proteína ampla desdobramento, agregação e morte de células. Portanto, as células desenvolveram uma rede dinâmica e stress específico de chaperones moleculares, que mantêm um proteome “saudável” durante condições de estresse. Independente de ATP acompanhantes constituem uma classe principal de chaperones moleculares, que servem como moléculas de defesa de primeira linha, protegendo contra a agregação da proteína em uma maneira dependente do stress. Uma característica que destes acompanhantes têm em comum é sua capacidade de utilizar a plasticidade estrutural para sua ativação específicas de stress, reconhecimento e liberação do cliente misfolded.

Neste trabalho, focalizamos a análise estrutural e funcional de um tal acompanhante intrinsecamente desordenado, a Hsp33 bacteriana redox-regulado, que protege as proteínas contra agregação durante o estresse oxidativo. Aqui, nós apresentamos uma caixa de ferramentas de diversas técnicas para estudar a atividade de acompanhante redox-regulada, bem como para mapear mudanças conformacionais do acompanhante, subjacente a sua actividade. Especificamente, podemos descrever um fluxo de trabalho que inclui a preparação de proteínas totalmente reduzidas e totalmente oxidadas, seguido por uma análise do acompanhante atividade antiagregação em vitro usando espalhamento de luz, incidindo sobre o grau da atividade antiagregação e sua cinética. Para superar valores atípicos frequentes acumulados durante os ensaios de agregação, descrevemos o uso de Kfits, uma nova ferramenta gráfica que permite fácil processamento das medições de cinéticas. Esta ferramenta pode ser facilmente aplicada a outros tipos de medições cinéticas para remoção de outliers e ajuste de parâmetros cinéticos. Para correlacionar a função com a estrutura da proteína, descrevemos a configuração e fluxo de trabalho de uma técnica de espectrometria de massa estrutural, hidrogênio-deutério troca espectrometria de massa, que permite o mapeamento de mudanças conformacionais sobre o acompanhante e substrato durante diferentes estágios de atividade Hsp33. A mesma metodologia pode ser aplicada a outras interações da proteína-proteína e proteína-ligante.

Introduction

Células frequentemente encontram um acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS) produzidos como subprodutos da respiração1,2, proteínas e lipídios oxidação3,4e processos adicionais5, 6,7. Apesar de papel benéfico de ROS em diversos processos biológicos, tais como celular, sinalização8,9 e resposta imune10, um desequilíbrio entre a produção de ROS e sua desintoxicação pode ocorrer, líder de oxidativo estresse7. Os alvos biológicos de ROS são proteínas, lípidos e ácidos nucleicos, a oxidação do que afetam sua estrutura e função. Portanto, o acúmulo de oxidantes celulares está fortemente ligado a uma variada gama de patologias, incluindo câncer de9,11, inflamação12,13e envelhecimento14, 15e foram encontrados para ser envolvido no aparecimento e progressão das doenças neurodegenerativas, como Alzheimer, Parkinson e ALS doença16,17,18.

Proteínas recém sintetizadas e maduras são altamente sensíveis à oxidação devido as modificações potencialmente prejudiciais de suas cadeias laterais, que forma a proteína estrutura e função de19,20. Portanto, o estresse oxidativo geralmente leva a uma inativação da proteína generalizada, enrolamento e agregação, eventualmente levando a morte celular. Uma das estratégias para lidar com o dano potencial de oxidação da proteína celulares elegantes é utilizar a acompanhantes redox-dependente, que inibem a agregação da proteína generalizada, em vez de formar complexos estáveis com proteínas misfolded cliente21 ,22,23. Estes acompanhantes de primeira linha de defesa rapidamente são ativados por uma site-specific oxidação (normalmente em resíduos de cisteína) que converte-los em potente antiagregação de moléculas24. Desde que o estresse oxidativo resulta na inibição da respiração e em diminuições na ATP celular níveis25, canônicos acompanhantes ATP-dependente são menos eficazes durante estresse oxidativo condições25,26 ,27. Portanto, acompanhantes de ATP independente redox-ativado desempenham um papel vital na manutenção da homeostase de proteína sobre a acumulação de oxidantes em bactérias e eucariotas (por exemplo, Hsp3328 e RidA29 em bactérias, Get330 no fermento, peroxiredoxins31 em eucariontes). A atividade destes acompanhantes depende fortemente reversíveis mudanças conformacionais estruturais induzidas por uma site-specific oxidação que revela regiões hidrofóbicas envolvidos no reconhecimento de proteínas misfolded cliente.

Investigação do mecanismo de antie agregação os princípios que regem o reconhecimento das proteínas do cliente por acompanhantes não é fácil devido à natureza dinâmica e heterogêneo de acompanhante-substrato interações32,33, 34,35,36,37. No entanto, stress-regulado acompanhantes têm a oportunidade de avançar nossa compreensão da função de antidevido agregação à sua capacidade para: 1) obter de duas formas diferentes da dama de companhia, ativo (por exemplo, oxidado) e inativos (por exemplo, reduzido), com a introdução ou remoção de uma condição de estresse facilmente alternar entre eles (por exemplo, oxidante e agente redutor), 2) tem uma ampla gama de substratos, 3) formam complexos altamente estáveis com as proteínas de cliente que podem ser avaliadas por diferentes metodologias estruturais e 4) focar exclusivamente o reconhecimento do substrato e lançamento, mediada por mudanças conformacionais redox dependentes, como a maioria destes acompanhantes não tem a capacidade de dobramento.

Aqui, analisamos atividade antiagregação do acompanhante bacteriana redox-regulada do Hsp33, um componente vital do sistema de defesa bacteriana contra a proteína induzida por oxidação agregação28. Quando reduzida, Hsp33 é uma proteína ligadora de zinco firmemente dobrada com nenhuma atividade de acompanhante; no entanto, quando expostos a estresse oxidativo, Hsp33 sofre grandes mudanças conformacionais que expõem seu substrato vinculação regiões38,39. Após a oxidação, o íon de zinco que está fortemente ligado a quatro resíduos de cisteína altamente conservadas do domínio C-terminal é lançado40. Isso resulta na formação de ligações de bissulfeto dois, um desdobramento do domínio C-terminal e uma desestabilização do vinculador adjacente região41. Os C-terminal e vinculador regiões são altamente flexíveis e são definidas como intrinsecamente ou parcialmente desordenada. Após retornar às condições anti-stress, reduzidas as cisteínas e o acompanhante retorna ao seu estado nativo dobrado com nenhuma atividade antiagregação. O dobrar do acompanhante leva a um maior desdobramento e desestabilização da proteína do limite do cliente, que desencadeia a sua transferência para o sistema de acompanhante canônico, DnaK/J, por redobramento38. Análise de sites de interação do Hsp33 sugere que a Hsp33 usa ambos que sua carregada desordenada regiões, bem como as regiões hidrofóbicas no vinculador e domínio N-terminal para capturar misfolded proteínas do cliente e impede sua agregação38, 42. no estado dobrado, estas regiões estão escondidas pelo vinculador dobrado e domínio C-terminal. Curiosamente, a região de vinculador serve como um guardião dobrado e inativo do Hsp33 estado de, “sentindo” o status de dobramento de seu adjacente de domínio C-terminal34. Uma vez desestabilizado por mutagênese (seja por uma mutação de ponto ou de uma perturbação da sequência completa), Hsp33 é convertido para um acompanhante constitutivamente ativo independentemente o estado redox do seu redox sensíveis cisteínas43.

Os protocolos aqui apresentados permitem monitoramento de atividade de acompanhante redox dependentes do Hsp33, bem como mudanças conformacionais de mapeamento sobre a ativação e a ligação de proteínas do cliente. Esta metodologia pode ser adaptada para outros modelos de reconhecimento de acompanhante-cliente, bem como interações da proteína-proteína de não-acompanhante de investigação. Além disso, apresentamos os protocolos para a preparação de acompanhantes totalmente reduzidas e oxidadas que podem ser usados em estudos de outras proteínas redox-switch, para revelar as funções potenciais de oxidação de proteínas sobre a atividade da proteína.

Especificamente, nós descrevemos um procedimento para monitorar acompanhante atividade em vitro e definir sua especificidade de substrato sob diferentes tipos de agregação de proteínas (quimicamente ou termicamente induzido) usando espalhamento de luz (LS) medido por um fluorospectrometer44. Durante a agregação, luz espalhamento no 360 nm aumenta rapidamente devido a turbidez crescente. Assim, a agregação pode ser monitorada em uma maneira dependente do tempo neste comprimento de onda. LS é um método rápido e sensível para os testes de agregação de proteínas e, portanto, a atividade antiagregação de uma proteína de interesse usando nanomolar concentrações, permitindo a caracterização de parâmetros cinéticos relacionados a agregação da proteína sob diferentes condições. Além disso, o protocolo é descrito aqui não requer instrumentação cara e pode ser facilmente estabelecido em qualquer laboratório.

No entanto, é bastante desafiador para obter curvas cinéticas “limpo” e para derivar parâmetros cinéticos de uma proteína tal luz dispersando experiências, devido ao ruído e ao grande número de exceções geradas por bolhas de ar e grandes agregados. Para superar este obstáculo, apresentamos uma nova ferramenta gráfica, Kfits45, usado para reduzir os níveis de ruído em diferentes medidas cinéticas, especificamente equipados para dados cinéticos de agregação de proteínas. Este software fornece parâmetros cinéticos preliminares para uma avaliação inicial dos resultados e permite que o usuário para “limpar” grandes quantidades de dados rapidamente sem afetar suas propriedades cinéticas. Kfits é implementado em Python e disponível em open source em 45.

Uma das questões desafiadoras no campo diz respeito ao mapeamento de sites de interação entre acompanhantes e suas proteínas de cliente e compreensão como acompanhantes reconhecem uma ampla gama de substratos misfolded. Esta questão é ainda mais complicada quando estudar complexos de proteínas altamente dinâmico que envolvem intrinsecamente desordenado acompanhantes e substratos sujeitos a agregação. Felizmente, espectrometria de massa estrutural avançou dramaticamente na última década e forneceu com sucesso útil abordagens e ferramentas para analisar a plasticidade estrutural e mapear resíduos envolvidos no reconhecimento de proteínas46, 47 , 48 , 49. aqui, nós apresentamos uma tal técnica-hidrogênio-deutério troca espectrometria de massa (HDX-MS)-que permite o mapeamento das alterações no nível do resíduo em uma conformação estrutural sobre modificação de proteína ou proteína/ligante ligação35, 50,,51,52,53,54,55. HDX-MS usa o intercâmbio contínuo de hidrogênios espinha dorsal por deutério, a taxa que é afectada pelo ambiente químico, acessibilidade, e ligações covalentes e não-covalentes56. HDX-MS acompanha estes processos do exchange usando um solvente deuterado, comumente água pesada (D.2O) e permite a medição com base na mudança no peso molecular após o hidrogênio para troca de deutério. Taxas mais lentas de intercâmbio de hidrogênio-deutério podem resultar de hidrogênios participando de ligações de hidrogênio ou, simplesmente, de estérico, que indica alterações locais na estrutura57. Alterações em cima de uma ligação de ligante ou modificações borne-translational também podem levar a diferenças no ambiente de hidrogênio, com uma ligação, resultando em diferenças nas taxas de câmbio (HDX) o hidrogênio-deutério46,53.

Nós aplicamos esta tecnologia para as regiões 1) mapa Hsp33, que rapidamente se desdobrar em cima de oxidação, levando a ativação de Hsp33 e 2) definem a interface de ligação potencial de Hsp33 com seu substrato de misfolded completo, citrato sintase (CS)38.

Os métodos descritos neste manuscrito podem ser aplicados para estudar funções redox dependentes de proteínas em vitro, definindo atividade antiagregação e o papel das mudanças estruturais (se houver), em função da proteína. Essas metodologias podem ser facilmente adaptadas aos diversos sistemas biológicos e aplicadas no laboratório.

Protocol

1. preparação de proteínas totalmente reduzidas e totalmente oxidadas Preparação de uma proteína totalmente reduzidaNota: Aqui, descrevemos a redução de uma proteína que contêm zinco e uso um ZnCl2 solução para restaurar o estado de proteína Zn-incorporada, reduzida. A ZnCl2 solução pode ser substituída ou descartada. Observe que o tempo e a temperatura do processo de redução depende da estabilidade da proteína e função e assim é específicos por…

Representative Results

Os dois métodos apresentados possibilitam acompanhar a atividade cinética e dinâmica de interações da proteína entre acompanhante e seu substrato. Além disso, o protocolo de redução-oxidação permite a preparação de um acompanhante totalmente reduzida e totalmente oxidado, dando uma compreensão mais profunda do mecanismo de ativação de redox dependentes desordenadas acompanhantes. Primeiro, usamos o espalhamento d…

Discussion

Neste trabalho, nós fornecemos os protocolos para a análise da atividade de acompanhante redox-dependente e a caracterização das mudanças estruturais sobre a ligação de uma proteína do cliente. Estas são metodologias complementares para definir o potencial complexos de acompanhante-substrato e analisar possíveis sites de interação.

Aqui, nós aplicamos esses protocolos para a caracterização de um complexo entre o acompanhante regulamentadas redox Hsp33 com um substrato bem estuda…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores são gratos a Meytal Radzinski para suas discussões úteis e crítica de leitura do artigo e Patrick Griffin e seus membros de laboratório para sua assistência ilimitada ao estabelecer a plataforma de análise HDX. Os autores agradecem a Fundação alemã-Israel (I-2332-1149.9/2012), a Fundação científica Binacional (2015056), a concessão de integração de Marie-Curie (618806), a Israel Science Foundation (1765/13 e 2629/16) e a ciência humana de fronteira Programa (CDA00064/2014) pelo apoio financeiro.

Materials

Chemicals, Reagents
Acetonitrile HPLC plus Sigma Aldrich 34998-2.5L solvent
Formic acid Optima LC/MS Fisher Chemicals A117-50 solvent supplement
Isopropyl alcohol, HPLC grade Fisher Chemicals P750717 solvent
Methanol Fisher Chemicals A456-212 solvent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Aldrich 252859 buffer
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 76-05-1 solvent
Water for HPLC Sigma Aldrich 270733-2.5L-M solvent
ZnCl2, Zinc Chloride Merck B0755416 308 reagent
DTT goldbio 27565-41-9 reducing agent
PD mini trap G-25 columns GE healthcare GE healthcare 29-9180-07 desalting column
Potassium Phosphate United states Biochemical Corporation 20274 buffer
Hydrogen peroxide 30% Merck K46809910526 oxidizing agent
citrate synthase sigma aldrich C3260 substrate
HEPES acid free sigma aldrich 7365-45-9 buffer
Gndcl sigma aldrich G3272-500G denaturant
Deuterium Chloride Solution sigma aldrich 543047-10G buffer
Deuterium Oxide 99% sigma aldrich 151882-100G solvent
TCEP bioworld 42000058-2 reducing agent
150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
quartz cuvette Hellma 101-QS
Instruments
Jasco FP-8500 Fluorospectrometer Jasco
Thermomixer Comfort Eppendorf 13058/0
Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge Thermo Scientific
pH meter , PB-11 sartorius Sartorius 13119/0
AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter). AffiPro
Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) Waters
C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm)
Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door COY
Q-exactive-orbitrap mass spectrometer Thermo-Fischer Scientific
PAL system LHX – robotic system for handling HDX samples PAL system https://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, XRS pump Thermo Scientific
Dionex AXP-MS auxiliary pump Thermo Scientific
Software, Software Tools, Database search
Kfits: Fit aggregation Data http://kfits.reichmannlab.com/fitter/
Thermo Scientific Xcalibur software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Chronos software (Axel Semrau) http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
Proteome Discoverer V1.4 software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
HDX workbench software http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Keywords: Hsp33Chaperone ActivityHydrogen-deuterium ExchangeMass SpectrometryOxidative StressProtein AggregationProtein DynamicsEnzyme InteractionsVisual Demonstration
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Fassler, R., Edinger, N., Rimon, O., Reichmann, D. Defining Hsp33’s Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (136), e57806, doi:10.3791/57806 (2018).
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