גילוי חלבונים לוקליזציה Subcellular על ידי ירוק פלורסצנטיות חלבון Tagging ו 4', 6-Diamidino-2-phenylindole מכתים ב Caenorhabditis elegans
Summary
פרוטוקול זה מדגים כיצד לעקוב אחר חלבונים גרעיניים התקה תחת עומס חום באמצעות של זריחה ירוק (GFP) פיוז’ן חלבון כסמן ו 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) מכתים. דאפי מכתים פרוטוקול מהיר ושומר את האותות לוקליזציה subcellular GFP וחלבון.
Abstract
זה פרוטוקול, קרינה פלואורסצנטית ירוק (GFP) פיוז’ן חלבון ו 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) צביעת משמשים כדי לעקוב אחר שינויים לוקליזציה subcellular חלבון; בפרט, התקה גרעיני תחת חום להדגיש תנאי. חלבונים מגיבים אותות בהתאמה עד חיצוניים ופנימיים. מנגנון משותף היא לשנות לוקליזציה subcellular שלה. מאמר זה מתאר פרוטוקול כדי לעקוב אחר לוקליזציה חלבון שלא דורש נוגדן, תיוג רדיואקטיבי או מיקרוסקופ קונפוקלי. במאמר זה, משמש GFP כדי לתייג את היעד חלבון טקרמ-1 ב- C. elegans, חבר של משפחת חלבונים (CLICs) של ערוץ תאיים כלוריד כולל יונקים CLIC4. קו הטרנסגניים translational משולב טקרמ-1::gfp (עם מקדם מכירות ו רצף הגן המלא) נוצרה על ידי שינוי, γ-קרינה, stably מבטא את הגן gfp. מחקרים אחרונים הראו כי על עומס חום, סטרס חמצוני לא, 1::GFP טקרמ מצטבר בגרעין. חופפים את האות ה-GFP עם מבנה הגרעינים והן את דאפי אותות מאשר את השינויים לוקליזציה subcellular טקרמ-1 תחת לחץ… פרוטוקול זה מציג שתי שיטות קיבוע שונות דאפי מכתים: קיבוע אתנול, קיבוע אצטון. פרוטוקול מכתימים דאפי שהוצגו במאמר זה הוא מהיר ויעיל ושומר את האות ה-GFP והן את השינויים subcellular לוקליזציה של חלבון. שיטה זו דורשת רק מיקרוסקופ זריחה עם Nomarski, מסנן FITC מסנן דאפי. היא מתאימה עבור הגדרה מעבדה קטנה, סטודנט לתואר ראשון מחקר, מחקר תלמיד תיכון וכיתות ביוטכנולוגיה.
Introduction
שינוי של לוקליזציה subcellular חלבון הוא מנגנון משותף בתגובה לאותות פנימיים או חיצוניים כגון עומס חום, הרעבה, סטרס חמצוני, אפופטוזיס, זירחון חלבונים ועוד. לדוגמה, עומס חום גורם שייך FOXO הדף היומי-16 רוברטסונית גרעיני1,2, ואת החלבון BCL-2 פרו-אפופטוטיים להיפגע שההצעה translocates המיטוכונדריה עם מותו המקבל איתות3,4. טכניקות שונות זמינים לזהות שינויים אלה. שילוב של סופג המערבי ובידוד מבחינה ביוכימית subcellular מבנים (למשל, המיטוכונדריה או הגרעינים) טוב להשיג את המטרה3. עם זאת, זה דורש של נוגדנים ספציפיים נגד החלבון עניין. לפיכך, נוגדן ומבוססת הופך המפתח להצלחה. גישה חלופית היא תווית שונה מבנים subcellular או organelles עם סמנים שונים כגון חלבון פלורסצנטיות ירוק (GFP), חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP), חלבון פלורסצנטיות צהוב (YFP) mCherry, ולאחר בינתיים תווית החלבון של עניין עם סמנים אחרים. לאחר מכן, לבחון אותם תחת מיקרוסקופ קונפוקלי למקם את מטרות5,6. איזוטופים רדיואקטיביים הינם בחירה חלופיים עבור תיוג חלבונים היעד וכן ואז זיהוי שלהם לוקליזציה subcellular7. עם זאת, שיטה זו מחייבת הכשרה מתאימה וטיפול פסולת רדיואקטיבית. בנסיבות כגון חוסר נוגדנים ספציפיים, העדר של סמן ראוי, או את scarceness של ציוד כגון מיקרוסקופ קונפוקלי, גישה אלטרנטיבית צריך להיחשב. כדי לזהות חלבונים גרעיניים התקה, זה מושך רק לסמן את היעד החלבונים עם סמן, כתם גרעינים עם הכימית כימית 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) מאז זה רק דורש מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית רגילה.
Immunolabeling C. elegans עם נוגדנים הוא מאתגר בשל החדירות הנמוכה של קליפת או את הקוטיקולה סילוק המקיפים את החיה. בינתיים, מאז C. elegans חלבונים מתבדרת באופן משמעותי מן orthologs חוליות שלהם, כמה חברות מסחריות לספק C. elegans עם מוצרים ספציפיים. . קשה לי מעבדה קטנה ליצירת נוגדנים C. elegans עבור עצמם. חוקרים בקהילה מרבים להשתמש חלבונים מתויג כסמני להפגין ביטוי חלבון לוקליזציה או הגן. מאמר זה משתמש טקרמ-1::GFP בתור דוגמה לאתר חלבון התקה גרעיני תחת מתח חום8. משולב translational טקרמ-1::gfp לתוך הגנום בעלי חיים משמש לבטא stably את הגן עם gfp פיוז’ן. המחקר הראה שכי טקרמ-1 מתבטאת המעי, לגוף החומה שרירים אחרים מבני subcellular8. פרוטוקול זה מדגים כיצד לסנכרן תולעים. כדי השלב הרביעי זחל (L4), לבצע חום מתח הניסוי, ואת התנהגות דאפי מכתים, אתנול קיבעון, קיבוע אצטון, הדמיה במיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית רגילה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה הציג שיטה מהירה ויעילה כדי לוודא שינויים subcellular חלבון של הציטופלסמה את הגרעין. הביטוי חלבון הוצג על ידי היתוך GFP, בעוד המבנה גרעין אומתה על ידי דאפי מכתים (איור 3). מאז immunostaining C. elegans חלבונים הוא מאתגר, הגרסא subcellular המקומית חלבון C. elegans רוב מאופיינים על-ידי תיו?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
זנים C. elegans השתמשו במחקר זה התקבלו ממרכז גנטיקה Caenorhabditis, אשר נתמך על ידי מכוני הבריאות הלאומיים – Office של תשתית תוכניות מחקר (P40 OD010440). עבודה זו נתמכה על ידי NIH: 1R03AG048578-01 Jun ליאנג, הנטר-CCRG 1501 Jun ליאנג ולאחר PSC-הנטר 66184-00 44 ו-45 67248-00 Jun ליאנג. אנו מודים קאתי סבג-דאן בטובך לחלוק לה מרחב מעבדה. כל התמונות פלורסצנטיות נאספו במתקן הליבה במכללת קווינס. אנו מודים וויליאם ג’יי רייס על הערותיו על כתב היד.
Materials
| DAPI | Biotium | 40043 | both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well |
| OP50 | CGC | OP50 | https://cgc.umn.edu/ |
| Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | ||
| Kim Wipe | Kimberly-Clark Corporation | soft tissue | |
| Zeiss AX10 | Zeiss | fluorescence microscope | |
| Axiovision Rel 4.8 | Zeiss | microscope software | |
| AxioCam MR Rev3 | Zeiss | digital camera | |
| Incubator | |||
| Micro centrifuge | |||
| Transparent nail polish gel | |||
| 60 mm petri dishes | |||
| Glass slides | |||
| Glass coverslips | |||
| 1-20 µL pipettor | |||
| 20-200 µL pipettor | |||
| 200-1000 µL pipettor | |||
| 1-200 µL pipet tips | |||
| 200-1000 µL pipet tips | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Platinum wire worm pick |
Referencias
- Essers, M. A., et al. FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK. The EMBO Journal. 23 (24), 4802-4812 (2004).
- Oh, S. W., et al. JNK regulates lifespan in Caenorhabditis elegans by modulating nuclear translocation of forkhead transcription factor/DAF-16. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (12), 4494-4499 (2005).
- Gross, A., et al. Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death. The Journal of Biological Chemistry. 274 (2), 1156-1163 (1999).
- Doerflinger, M., Glab, J. A., Puthalakath, H. BH3-only proteins: a 20-year stock-take. The FEBS Journal. 282 (6), 1006-1016 (2015).
- Mayorova, T. D., et al. Cells containing aragonite crystals mediate responses to gravity in Trichoplax adhaerens (Placozoa), an animal lacking neurons and synapses. PLoS One. 13 (1), e0190905 (2018).
- Terron-Camero, L. C., Molina-Moya, E., Sanz-Fernandez, M., Sandalio, L. M., Romero-Puertas, M. C. Detection of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) during hypersensitive cell death. Methods in Molecular Biology. , 97-105 (2018).
- Pedrazzini, E., Vitale, A. Protein biosynthesis and maturation in the ER. Methods in Molecular Biology. , 179-189 (2018).
- Liang, J., Shaulov, Y., Savage-Dunn, C., Boissinot, S., Hoque, T. Chloride intracellular channel proteins respond to heat stress in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (9), e0184308 (2017).
- Evans, T. C. Transformation and microinjection. Wormbook. , (2006).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
- Yochem, J. Nomarski images for learning the anatomy, with tips for mosaic analysis. Wormbook. , (2006).
- Dulhunty, A., Gage, P., Curtis, S., Chelvanayagam, G., Board, P. The glutathione transferase structural family includes a nuclear chloride channel and a ryanodine receptor calcium release channel modulator. The Journal of Biological Chemistry. 276 (5), 3319-3323 (2001).
- Suh, K. S., Malik, M., Shukla, A., Yuspa, S. H. CLIC4, skin homeostasis and cutaneous cancer: surprising connections. Molecular Carcinogenesis. 46 (8), 599-604 (2007).
- Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M., Kong, B. CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. 22 (3), 541-548 (2009).
- Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Edwards, J. C., Petersen, O. W. Differential expression of a chloride intracellular channel gene, CLIC4, in transforming growth factor-beta1-mediated conversion of fibroblasts to myofibroblasts. The American Journal of Pathology. 161 (2), 471-480 (2002).
- He, G., et al. Role of CLIC4 in the host innate responses to bacterial lipopolysaccharide. European Journal of Immunology. 41 (5), 1221-1230 (2011).
- Zhong, J., et al. Inhibition of CLIC4 enhances autophagy and triggers mitochondrial and ER stress-induced apoptosis in human glioma U251 cells under starvation. PLoS One. 7 (6), e39378 (2012).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130 (26), 6453-6464 (2003).
- Leopold, L. E., Heestand, B. N., Seong, S., Shtessel, L., Ahmed, S. Lack of pairing during meiosis triggers multigenerational transgene silencing in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), E2667-E2676 (2015).
- Schultz, R. D., Bennett, E. E., Ellis, E. A., Gumienny, T. L. Regulation of extracellular matrix organization by BMP signaling in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (7), e101929 (2014).
- Matus, D. Q., et al. Invasive cell fate requires G1 cell-cycle arrest and histone deacetylase-mediated changes in gene expression. Developmental Cell. 35 (2), 162-174 (2015).
- Reddy, K. C., Villeneuve, A. M. C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination. Cell. 118 (4), 439-452 (2004).
- Ames, K., et al. A non-cell-autonomous role of BEC-1/BECN1/Beclin1 in coordinating cell-cycle progression and stem cell proliferation during germline development. Current Biology. 27 (6), 905-913 (2017).
- Pekar, O., et al. Linking the environment, DAF-7/TGFbeta signaling and LAG-2/DSL ligand expression in the germline stem cell niche. Development. 144 (16), 2896-2906 (2017).
- Schvarzstein, M., et al. DNA helicase HIM-6/BLM both promotes MutSgamma-dependent crossovers and antagonizes MutSgamma-independent interhomolog associations during caenorhabditis elegans meiosis. Genética. 198 (1), 193-207 (2014).
- Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).
- Nagamatsu, Y., Ohshima, Y. Mechanisms for the control of body size by a G-kinase and a downstream TGFbeta signal pathway in Caenorhabditis elegans. Genes to Cells. 9 (1), 39-47 (2004).
