Detectar a localização Subcellular da proteína por marcação de proteína de fluorescência verde e 4' 6-Diamidino-2-phenylindole de coloração em Caenorhabditis elegans
Summary
Este protocolo demonstra como controlar uma translocação nuclear da proteína sob estresse de calor, usando uma fluorescência verde (GFP) de proteína proteína da fusão como um marcador e 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) coloração. O DAPI protocolo de coloração é rápido e preserva os sinais de Localização subcellular GFP e proteína.
Abstract
Neste protocolo, uma proteína de fusão de proteína (GFP) fluorescência verde e 4′ 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) coloração são usados para controlar alterações de Localização subcellular da proteína; em particular, uma translocação nuclear sob um calor salientar a condição. As proteínas reagem sinais correspondentemente para interno e externos. Um mecanismo comum é mudar sua localização subcellular. Este artigo descreve um protocolo para rastrear a localização da proteína que não requer um anticorpo, etiquetar radioativo ou um microscópio confocal. Neste artigo, GFP é usado para marcar a proteína alvo EXL-1 em c. elegans, um membro da família cloreto intracelular canal proteínas (CLICs), incluindo mamíferos CLIC4. Uma linha de transgénicos integrado translacional exl-1::gfp (com um promotor e uma sequência genética completa) foi criada por transformação e γ-radiação e estàvel expressa o gene e gfp. Pesquisas recentes mostraram que em cima de stress de calor, estresse oxidativo não, EXL-1::GFP acumula-se no núcleo. Sobrepondo o sinal GFP com a estrutura de núcleos e o DAPI sinais confirma as alterações de Localização subcellular EXL-1 sob estresse. Este protocolo apresenta dois métodos de fixação diferentes para coloração de DAPI: fixação de etanol e fixação de acetona. O protocolo de coloração de DAPI apresentado neste artigo é rápido e eficiente e preserva tanto o sinal GFP e as mudanças de Localização subcellular da proteína. Este método requer apenas um microscópio de fluorescência com Nomarski, um filtro FITC e um filtro DAPI. É apropriado para um ajuste pequeno laboratório, pesquisa de estudante de graduação, pesquisa de estudantes de ensino médio e salas de aula de biotecnologia.
Introduction
Uma mudança de localização Subcellular da proteína é um mecanismo comum em resposta a sinais internos ou externos, tais como o stress de calor, fome, estresse oxidativo, apoptose, fosforilação de proteínas e outros. Por exemplo, stress de calor induz um membro FOXO DAF-16 translocação nuclear1,2e a proteína BCL-2 de pro-apoptotic que oferta translocates para a mitocôndria após recebimento morte sinalização3,4. Várias técnicas estão disponíveis para detectar essas alterações. Uma combinação de mancha ocidental e bioquimicamente isolando estruturas subcelulares (por exemplo, as mitocôndrias ou núcleos) bem poderia alcançar o objetivo3. No entanto, requer um anticorpo específico contra a proteína de interesse. Um anticorpo bem-estabelecida torna-se assim, a chave para o sucesso. Uma abordagem alternativa é para rotular diferentes estruturas subcelulares ou organelas com vários marcadores tais como proteínas fluorescência verde (GFP), proteína de fluorescência vermelha (RFP), proteína de fluorescência amarela (YFP) e mCherry e enquanto isso rotular a proteína de interesse com outros marcadores. Em seguida, observá-los sob um microscópio confocal para localizar os alvos5,6. Isótopos radioativos são uma escolha alternativa para rotular as proteínas alvo e então detectando sua localização subcellular7. No entanto, este método requer formação adequada e tratamento de resíduos radioactivos. Em circunstâncias como a falta de um anticorpo específico, a ausência de um marcador adequado ou a escassez de equipamentos, tais como um microscópio confocal, uma abordagem alternativa precisa ser considerado. Para identificar uma translocação nuclear da proteína, é atraente para rotular apenas as proteínas alvo com um marcador e manchar os núcleos com o reagente químico 4′ 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), desde que isto requer apenas um microscópio de fluorescência regular.
Immunolabeling c. elegans com anticorpos é desafiadora devido a baixa permeabilidade da casca da ovo ou da cutícula colágenas em torno do animal. Entretanto, desde que o c. elegans proteínas são significativamente divergentes de suas orthologs de vertebrados, algumas empresas comerciais fornecem c. elegans com produtos específicos. É difícil para um pequeno laboratório gerar anticorpos c. elegans por si mesmos. Pesquisadores na Comunidade usam proteínas etiquetadas como marcadores para demonstrar uma expressão de localização ou do gene da proteína. Este artigo usa EXL-1::GFP como um exemplo, para controlar uma translocação nuclear da proteína sob estresse de calor8. Uma translação integrado exl-1::gfp no genoma do animal é usado para expressar estàvel o gene com fusão de gfp . Pesquisas mostraram que exl-1 é expressa no intestino, músculo da parede do corpo e outras estruturas subcelulares8. Este protocolo demonstra como sincronizar vermes à fase larval quarta (L4), executar um calor stress experimento e conduta DAPI de coloração, etanol fixação, fixação de acetona e imagem de um microscópio de fluorescência regular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo apresenta um método rápido e eficiente para verificar as alterações Subcellular da proteína do citoplasma para o núcleo. A expressão da proteína foi mostrada por uma fusão de GFP, enquanto a estrutura do núcleo foi verificada por DAPI coloração (Figura 3). Desde que immunostaining proteínas de c. elegans é um desafio, a maioria das localizações da proteína c. elegans subcellular caracterizam-se por marcá-los com proteínas marcador como GFP, La…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
As cepas de c. elegans utilizadas neste estudo foram obtidas a partir do centro de genética Caenorhabditis, que é apoiado pelo National Institutes of Health – escritório da infra-estrutura de programas de pesquisa (OD010440 P40). Este trabalho foi financiado pelo NIH: 1R03AG048578-01 Jun Liang, CUNY-CCRG 1501 Jun Liang e PSC-CUNY 66184-00 44 e 45 67248-00 a Jun Liang. Agradecemos Cathy Savage-Dunn gentilmente partilha o seu espaço de laboratório. Todas as imagens de fluorescência foram coletadas no Queens College Core Facility. Agradecemos a William J. Rice por seus comentários sobre o manuscrito.
Materials
| DAPI | Biotium | 40043 | both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well |
| OP50 | CGC | OP50 | https://cgc.umn.edu/ |
| Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | ||
| Kim Wipe | Kimberly-Clark Corporation | soft tissue | |
| Zeiss AX10 | Zeiss | fluorescence microscope | |
| Axiovision Rel 4.8 | Zeiss | microscope software | |
| AxioCam MR Rev3 | Zeiss | digital camera | |
| Incubator | |||
| Micro centrifuge | |||
| Transparent nail polish gel | |||
| 60 mm petri dishes | |||
| Glass slides | |||
| Glass coverslips | |||
| 1-20 µL pipettor | |||
| 20-200 µL pipettor | |||
| 200-1000 µL pipettor | |||
| 1-200 µL pipet tips | |||
| 200-1000 µL pipet tips | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Platinum wire worm pick |
Referencias
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