Nanosensors 프로 테아 제 활동에 감지 비보에 비 침 투 적인 진단에 대 한
Summary
프로 테아 제는 기본적인 생물학 과정 및 암과 같은 복잡 한 질병의 dysregulated 프로 테아 제 활동 드라이브 진행에 관련 된 단단히 규제 효소. 이 방법의이 목표 호스트 소변에서 감지 하 고 질병을 차별 분열 신호를 생산 하 여 효소 활동에서 vivo에서 측정 하는 nanosensors를 만드는 것입니다.
Abstract
프로 테아 제는 다기능 효소 펩 티 드 결합의 가수분해에서 전문 및 항상성 등 allostasis 광범위 한 생물 학적 과정을 제어. 또한, dysregulated 프로 테아 제 활동 pathogenesis 드라이브 이며 암;과 같은 질병의 기능 바이오 마커 따라서, 효소 활동에서 vivo에서 감지 하는 능력은 생물 의학 진단에 대 한 임상 관련 정보를 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표 조사 효소 활동에서 vivo에서 소변에서 정량 신호를 생산 하 여 nanosensors를 만드는 것입니다. 이러한 효소 nanosensors의 두 가지 구성 요소 구성: 나노 및 기판. 대상 질병 사이트에 순환 반감기 및 기판 납품 증가를 나노 기능. 기판은 짧은 펩 티 드 순서 (6-8 AA), 대상 효소 또는 프로 테아의 그룹에 구체적으로 설계 된입니다. 기판은 나노 입자의 표면에 활용 하 고 탐지를 위한 형광 표식 같은 기자에 의해 종료 됩니다. Dysregulated 프로 테아 제 펩 티 드 기질 다니엘로 기자 프로 테아 제 활동의 한 biomarker로 정량화에 대 한 소변으로 필터링 됩니다. 여기는 매트릭스 metalloproteinase 9 (MMP9), 종양 진행 및 전이, 대 장 암 마우스 모델에서의 검출에 대 한 관련 된에 대 한 nanosensor의 건설에 설명 합니다.
Introduction
프로 테아 제 펩 티 드 결합의 가수분해를 전문화 하 고 항상성, 질병1, allostasis, 등 많은 생물 학적 과정을 중요 한 통제가 다기능 효소는. 프로 테아 제 활동의 변경된 상태 질병, 암 및 심장 혈관 질병, 프로 테아 제 임상 생체2,3으로 개발을 위한 매력적인 후보자를 만드는 등의 다양 한 상관 되었다. 또한, 프로 테아 제 활동은 별개에 기능적으로 연결 된 pathogeneses, 환자 결과 및4질병 예 후. 넓게, 바이오 센서 개발 되었습니다 다양 한 생물 학적 현상을 감지 하 고 질병, 암, 신경 질환, 전자 등 처리5,6,,78 , 9. 좀 더 구체적으로, 기판 기반 효소 센서 프로 테아 제 활동을 감지 하 여 진단 이미징10 fluorogenic 프로브 포함 개발 되었고 isotopically 펩 티 드 기질에 시험관 에 대 한 표시 질량 분석11탐지입니다. 또한, 활동 기반 프로브 개발 되었습니다, 바인딩하거나 대상 프로 테아 제12수정 기판 같은 영역을 포함 하는. 이 방법으로 활성 사이트 수정 하며 분석 조직, vivo에서 응용 프로그램을 제한의 수확 때 대상 효소 저해 irreversibly는. 그러나, 효소 활동의 규칙은 내 생 억제제의 존재와 같은 다른 생물 학적 활동의 문맥에 크게 의존 하기 때문에 효소 활동을 vivo에서, 감각을 중요 하다.
이 작품의 목표는 소변에서 측정 신호를 생산 하 여 효소 활동에서 vivo에서 검색 활동 기반 nanosensors의 공식 설명. 이 플랫폼 기능 biomarker로 dysregulated 프로 테아 제 활동을 사용 하 여 암과 같은 복잡 한 질병을 판별 하는 비 침범 성 진단으로 사용 됩니다. 산화 철 나노 입자 (IONP) 효소 기질에 활용 된 nanosensor 플랫폼에 의하여 이루어져 있다. 이러한 기판 프로 테아 제 쪼개 기판 때 출시 되는 형광 기자에 의해 종료 됩니다. 이러한 IONPs vivo에서순환, 질병 사이트, 지역화 및 기판 활성 질병 관련 된 프로 테아 제에 노출. 분열, 후 형광 기자 출시 되 고, 그들의 작은 크기로 인해 필터링 됩니다 소변에는 IONP에 uncleaved 기판 시체에 남아 있는 동안. 따라서, 효소 활동에서 vivo에서 증가 소변 (그림 1)에서 리포터의 높은 농도 발생 합니다. 우리의 플랫폼 소변 검사 이기 때문에, 아무 이미징 플랫폼 필수 이며 진단 신호는 소변에서 풍성 하 게.
이 플랫폼은 다양 한 질병 암, 섬유 증, 혈전 증13,14등을 감지 하 설계 될 수 있다. 여기 우리가 설명 하는 매트릭스 metallopeptidase 9 (MMP9)에서 고도 검색 하기 위해 nanosensors의 디자인 활동으로 대 장 암의 바이오 마커. 대 장 암은 약된 136,800 새로운 사례와 2014 혼자1550,300 죽음, 미국에서 암 사망의 두 번째 주요 원인이. 대 장 종양 세포 생성 MMP9 전이16뿐만 아니라 악성 진행, 매트릭스 저하, 운전 표시 되었습니다. 또한, 우리 문학17에서 MMP9에 대 한 적합 한 펩 티 드 기질 (PLGVRGK) 확인. 조기 암 발견 및 저가 포인트의 케어 진단13,,1418,19,20,21이 플랫폼을 사용할 수 있습니다.
그림 1: Nanosensor 활동 비보의 도식. Nanosensors는 본문을 통해 순환 하 고 질병의 사이트 지역화. 다음, 질병 관련 된 프로 테아 제 펩 티 드 기질 IONPs를 제시한 다니엘. 쪼개진된 파편의 크기 신장 클리어런스, 그들이 소변에서 지역화 하는 원인에 대 한 수 있습니다. 동물 소변 후 그들의 기자 분자에 의해이 펩 티 드 파편을 분석할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법은 나노 코어를 활용 하는 프로 테아 제 기판으로 구성 된 활동 기반 nanosensors의 개발을 설명 합니다. 쪼개진된 펩 티 드 제품은 5 nm23 및 비 침 투 적인 신호를 생성 하는 소변으로 필터의 신장 크기 여과 한계 보다 작은 때문에 분해 분열의 이벤트 “pharmacokinetic 스위치”, 불리는. 따라서, 그것은 유체역학 반경 5 보다 큰 나노 입자 또는 운반대를 사용 하는 것이 중요, 아무것?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 감독의 새로운 혁신 상 수상 (제에 의해 투자 되었다 DP2HD091793)입니다. NSF 대학원 연구 장학 프로그램 (보조금 번호 Q.D.M.는 지원 DGE-1650044). B.A.H는 국립 연구소의 건강 GT BioMAT 훈련 그랜트 보너스 번호 5T32EB006343에서 조오지 아 기술 대통령의 친교에 의해 지원 됩니다. G.A.K.는 버로우즈 환영 기금에서 과학적인 인터페이스에서 경력 수상을 보유 하고있다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.
Materials
| 0.2 µm syringe filters | VWR | 4652 | |
| 18G needle | VWR | 89134-024 | |
| 15 mL conicals | VWR | 89039-670 | |
| 250 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89000-362 | |
| Stir bar | VWR | 58949-006 | |
| Hot Plate/Magnetic Stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Glacial acetic acid | VWR | 97064-482 | |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Thermo Fisher | A13100 | |
| Iron (III) chloride hexahydrate | Sigma | 236489 | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma | 44939 | |
| Epichlorohydrin | Sigma | 45340-500ML-F | |
| DMF | Sigma | D4551 | |
| Ammonium Hydroxide | Sigma | 320145-500ML | |
| Sodium Hydroxide pellets | Sigma | 221465-500G | |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Sodium Borate | Sigma | B9876 | |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-100G | |
| Tris-HCl | Sigma | T5941 | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417 | |
| Dextran | Pharmacosmos | 5510 0020 9006 | |
| Amicon 15 mL 10k filters, 24 pk | Millipore | UFC901024 | |
| Amicon 15 mL 30k filters, 24 pk | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon 15 mL 100k filters, 24 pk | Millipore | UFC910024 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | NanoZS | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette | LifeTech | 66130 | |
| Dynabeads MyOne Tosylactivated | LifeTech | 65501 | |
| SIA | Life Tech | 22349 | |
| PEG 20k | Laysan Bio | MPEG-SH-20K-1g | |
| Fluorescein Antibody [2A3] | GeneTex | GTX10257 | |
| Hiload 16/600 superdex 200 | GE Healthcare | 45-002-490 | |
| Plate Reader | Fisher | BTCYT5M | |
| BD Insulin Syringes | Fisher | NC0872854 |
Referencias
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