Ein optischer Test zum synaptischen Vesicle Recycling in kultivierten Neuronen überexprimiert präsynaptischen Proteine
Summary
Wir beschreiben einen optischen Test zur synaptischen Vesikel (SV) recycling in kultivierten Neuronen. Kombinieren dieses Protokoll mit doppelten Transfektion einer präsynaptischen Marker und Protein des Interesses zum Ausdruck bringen kann wir finden präsynaptischen Websites, deren synaptischen Vesikel Recyclingkapazität, und bestimmen die Rolle des Proteins des Interesses.
Abstract
Bei aktiven präsynaptischen nervenausgänge unterziehen synaptischen Vesikel Zyklen von Exo und Endozytose. Beim recycling, der luminalen Domänen des SV transmembranen Proteine an der Zelloberfläche ausgesetzt. Eines dieser Proteine ist Synaptotagmin-1 (Syt1). Ein Antikörper gegen der luminalen Domäne der Syt1, einmal hinzugefügt, um dem Kulturmedium wird während des Exo-endocytotic Zyklus aufgegriffen. Diese Aufnahme ist proportional zur Menge des SV recycling und durch Immunfluoreszenz quantifiziert werden kann. Hier verbinden wir Syt1 Antikörper Aufnahme mit doppelten Transfektion von kultivierten hippocampal Neuronen. Dies ermöglicht uns (1) lokalisieren präsynaptischen Websites basierend auf Ausdruck der rekombinanten präsynaptischen Marker Synaptophysin, (2) bestimmen ihre Funktionalität mit Syt1 Aufnahme und (3) charakterisieren das Zielen und Wirkungen eines Proteins des Interesses, GFP-Rogdi.
Introduction
Studium der synaptischen Vesikel recycling ist wichtig bei der Bestimmung, wie präsynaptischen Eigenschaften, während Synaptische Plastizität oder in Reaktion auf die Störung der synaptischen Funktion verändern. Antikörper-Aufnahme bietet Studium Synaptotagmin-1 (Syt1) eine Methode zur Messung der Menge von recycling-SV. Syt1 ist ein SV-assoziierten Protein, das wirkt wie ein Ca2 + Sensor und ist notwendig für steht Freisetzung von Neurotransmitter-1,–2. Es ist ein transmembranen Protein mit einer C-terminalen cytoplasmatischen Domäne außerhalb der SV und eine N-terminale luminalen Domäne innerhalb der SV3. Bei Exozytose wird das externe Medium die luminalen Domäne der Syt1 ausgesetzt. Um diese externen Medium fügen wir Antikörper gegen die cytoplasmatischen Domäne, die während der Endozytose internalisiert wird. Diese Antikörper können man entweder mit Fluorophore oder Immunostained mit Sekundärantikörper4,5,6,7Pre konjugiert. Der Fluoreszenzintensität von der daraus resultierenden Immunosignal ist proportional zur Menge des SV recycling. Dieser Ansatz lässt sich bestimmen, konstitutiven und Depolarisation-induzierte SV recycling6,8.
Syt1 Aufnahme Assays können nach Virus-vermittelte Gentransfer auf praktisch alle Zellen in der Schale oder spärlich Transfektion von einer kleinen Anzahl von Zellen durchgeführt werden. Unsere Methode verbindet den Assay mit spärlich Doppel Transfektion von primären hippocampal Neuronen mit Calcium-Phosphat-9. Wir verwenden eine rekombinante Marker Protein bekannt zu akkumulieren bei Presynapses, eindringmittel tagged Synaptophysin zu lokalisieren präsynaptischen Klemmen und overexpress unser Protein des Interesses, Rogdi. Dies ermöglicht es uns testen ob Rogdi Ziele funktionale Synapsen und wirkt sich auf SV recycling. Das Gen Kodierung Rogdi wurde ursprünglich in einem Bildschirm für Drosophila-Mutanten zeichnet sich durch Gedächtnisstörungen10identifiziert. Mutationen im Rogdi-Gen verursachen beim Menschen eine seltene und verheerende Krankheit namens Kohlschütter-Tönz-Syndrom. Patienten leiden unter Zahnschmelz Fehlbildungen, sind Epilepsie und psychomotorische Verzögerungen; jedoch blieb die subzelluläre Lokalisation des genprodukts schwer fassbaren11. Somit bot die Syt1 Aufnahme Assay wichtige Beweismittel für die Lokalisierung von GFP-markierten Rogdi auf funktionale Synapsen9.
Diese Aufnahme-Technik hat mehrere Vorteile. Erstens kann SV recycling sowohl in Echtzeit durchführen live imaging7,12, und nach Fixierung6,9 beobachtet werden durch Messung der Fluoreszenzintensität des Syt1 Fluoreszenz Label. Darüber hinaus wurden mehrere Syt1 Antikörper Varianten entwickelt. Es gibt unmarkierten, die mit einem sekundären Antikörper nach einem standard Immunostaining Protokoll nach Fixierung beschriftet werden können, und Pre-konjugierten Varianten mit einem Fluoreszenz-Label bereits angebracht. Schließlich ist die Antikörper-basierten Fluoreszenz vorteilhaft durch die große Auswahl an handelsüblichen Sekundär- oder konjugierte Farbstoffe, die verwendet werden können.
Bei der Festsetzung und Immunostaining Neuronen, es ist auch möglich, für zusätzliche Proteine zu beflecken und ns1 Analysen durchführen. Dies kann helfen, festzustellen, wo sie sich in Bezug auf recycling SVs befinden. Die Intensität der Fluoreszenz-Label ist direktes Maß für die Höhe der SV-recycling. Darüber hinaus kennzeichnen die Antikörper selektiv Syt1-haltigen Strukturen, was hohe Spezifität und wenig Hintergrund-Fluoreszenz-4. Verschiedenen Protokolle können auch verwendet werden, z. B. Depolarisation Puffer oder elektrische Stimulation Protokolle9,12,13,14. Jedoch kann basalen SV recycling ohne Stimulierung der neuronalen Kulturen15gemessen werden.
Unsere Methode befasst sich speziell mit Syt1 Antikörper Aufnahme in Doppel-transfizierten Neuronen mit Sekundärantikörper Immunolabeling nach der Fixierung. Allerdings verweisen wir auf alle routinemäßig verwendeten Varianten des Tests in unserer Diskussion um Zuschauer geben die Möglichkeit, das Protokoll auf spezifischen Bedürfnisse anzupassen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt drei Tests routinemäßig zur synaptischen Vesikel (SV) recycling zu studieren. Die ersten beiden umfassen die Verwendung von einem) fluoreszierende Styryl Farbstoffe wie FM1-43 (die in Membranen zu integrieren, sind in den Organellen während Endozytose aufgenommen und werden nach Exozytose freigesetzt); und b) eindringmittel getaggt rekombinante SV-Proteine (die bei Überexpression, in die proteinhaltige recycling Maschinen integrieren). Wenn die angehängte Fluorophore ihre Fluoreszenz je nach pH-Wert ändern,…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Irmgard Weiss für kompetente technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der DFG über des Exzellenzclusters für Mikroskopie im Nanometerbereich und molekulare Physiologie des Gehirns (CNMPB, B1-7, T.D) unterstützt.
Materials
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BSA | Sigma | A7030-50g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306-100g | |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | ||
| dH2O | Invitrogen | 15230 | |
| DABCO | Merck | 8.03456.0100 | |
| donkey anti mouse Alexa 647 | Jackson-Immunoresearch | 715605151 | antibody |
| DMEM | Invitrogen | 41966 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| tube (50 mL) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| FBS superior | BiochromAG | S0615 | |
| Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170 | |
| HEPES | Sigma | H4034-500g | |
| Hera Cell 150 (Inkubator) | ThermoElectron Corporation | ||
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541-500g | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030 | |
| MgCl2 | Honeywell | M0250-500g | |
| microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| OpenView Experiment Analysis Application | Free software, see comments | written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Optimem | Invitrogen | 31985 | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| safety hood | ThermoElectron | Serial No. 40649111 | |
| Sucrose | neoFroxx | 1104kg001 | |
| Synaptotagmin1 | Synaptic Systems | 105311 | mouse monoclonal; clone 604.2 |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Water bath | GFL | 1004 | |
| Zeiss Observer. Z1 | Zeiss | ||
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