Sinaptik vezikül Presynaptic protein Overexpressing kültürlü nöronlarda geri dönüşüm için optik bir tahlil
Summary
Biz optik bir tahlil sinaptik vezikül (SV) kültürlü nöronlarda geri dönüşüm için açıklar. Bu iletişim kuralı bir presynaptic işaret ve protein ilgi ifade etmek için çift transfection ile birleştirerek presynaptic siteleri, onların sinaptik vezikül kapasitesi geri dönüşüm bulun ve faiz protein rolünü belirlemek için bize izin verir.
Abstract
Active presynaptic sinir terminallerine sinaptik veziküller exo – ve endositoz döngüleri tabi. Geri dönüşüm sırasında luminal etki alanları SV transmembran proteinler, hücre yüzeyi maruz olur. Bu proteinler biridir Synaptotagmin-1 (Syt1). Syt1, bir kez kültür ortamına eklenen luminal etki karşı bir antikor exo-endocytotic döngüsü sırasında alınır. Bu alımı SV geri dönüşüm miktarı ile doğru orantılıdır ve ayirt sayılabilir. Burada, Syt1 antikor alımını kültürlü hipokampal nöronlar Çift Kişilik transfection ile birleştirmek. Bu bize (1) yerelleştirmek rekombinant presynaptic işaretçisi Synaptophysin ifade üzerinde temel alan presynaptic siteleri (2) Syt1 alımını kullanarak onların işlevlerini belirleyin ve karakterize (3) hedefleme ve etkileri ilgi, GFP-Rogdi bir protein sağlar.
Introduction
Presynaptic özelliklerini değiştirmek, sinaptik plastisite sırasında veya Yanıt pertürbasyon sinaptik fonksiyon olarak nasıl sinaptik vezikül geri dönüşüm eğitim belirlemede önemlidir. Synaptotagmin-1 (Syt1) eğitim antikor alımını SV geri dönüşüm miktarını ölçmenin bir yöntem sağlar. Syt1 Ca2 + sensörü davranır ve nörotransmitter1,2exocytotic serbest bırakılması için gereklidir, SV ilişkili bir proteindir. Bir C-terminal sitoplazmik etki alanı dışında ZF ve SV3içinde N-terminal luminal etki alanı ile bir transmembran proteindir. Ekzositozu sırasında Syt1 luminal etki dış ortamına maruz olur. Bu dış orta, endositoz sırasında içselleştirilmiş olur sitoplazmik etki karşı antikorlar ekleyin. Bu antikorlar da önceden fluorophores veya immunostained ile ikincil antikorlar4,5,6,7ile Birleşik olabilir. Elde edilen immunosignal floresan yoğunluğu SV geri dönüşüm miktarı orantılıdır. Bu yaklaşım, kurucu ve depolarizasyon kaynaklı ZF6,8geri dönüşüm belirlemek için kullanılabilir.
Syt1 alımını deneyleri seyrek transfection hücreleri küçük bir dizi ya da virüs-aracılı gen transferi tabak içinde hemen hemen tüm hücrelere sonra gerçekleştirilebilir. Bizim Yöntem tahlil kalsiyum fosfat9kullanarak birincil hipokampal nöronlar seyrek Çift Kişilik transfection ile birleştirir. Presynapses biriktirmek için bilinen bir rekombinant marker protein fluorescently etiketli Synaptophysin, presynaptic terminalleri bulun ve bizim protein ilgi, Rogdi overexpress için kullanıyoruz. Bu Rogdi hedefleri fonksiyonel synapses ve geri dönüşüm SV etkiler olup olmadığını test bize sağlar. Rogdi kodlama gen aslında Drosophila mutantlar Engelliler bellek10tarafından karakterize bir ekran tespit edilmiştir. İnsanlarda, Kohlschütter-Tönz sendromu denen nadir ve yıkıcı bir hastalık Rogdi gen mutasyonlar neden. Hastalar diş mine malformasyonlar, pharmacoresistant epilepsi ve psikomotor gecikmeler muzdarip; Ancak, gen ürünü hücre altı lokalizasyonu zor11kaldı. Böylece, Syt1 alımını tahlil GFP öğesini Rogdi fonksiyonel sinapslarda9lokalizasyonu için anahtar kanıt sağladı.
Bu alımı teknik birçok faydası vardır. İlk olarak, SV geri dönüşüm hem gerçek zamanlı canlı görüntüleme7,12yaparak ve sonra fiksasyon6,9 Syt1 floresan etiket floresan yoğunluğu ölçme tarafından görülebilir. Ayrıca, çeşitli Syt1 antikor türevleri geliştirilmiştir. Standart immunostaining protokol fiksasyon sonra sonrası ikincil bir antikor ile etiketli etiketsiz türevleri ve önceden eklenmiş bir floresan etiketi önceden konjuge türevleri vardır. Son olarak, floresan antikor tabanlı kullanılan piyasada bulunan ikincil veya konjuge boyalar geniş yelpazesi nedeniyle avantajlıdır.
Ne zaman tamir ve immunostaining nöronlar, ayrıca ek proteinler için leke ve colocalization analiz gerçekleştirmek mümkündür. Bu geri dönüşüm SVs ile ilgili olarak bulundukları belirlemenize yardımcı olabilir. Floresans etiket yoğunluğunu geri dönüşüm SV miktarını doğrudan ölçüsüdür. Buna ek olarak, antikorlar seçmeli olarak yüksek özgüllük ve küçük arka plan floresans4ile sonuçlanan yapıları, Syt1 içeren etiket. Farklı stimulasyon protokolleri de, depolarizasyon arabellekleri veya elektrik stimulasyon protokolleri9,12,13,14gibi kullanılabilir. Ancak, bazal SV geri dönüşüm nöronal kültürler15uyarıcı olmadan ölçülebilir.
Bizim yöntem özellikle fiksasyon sonra Syt1 antikor Anlamazdın çift transfected nöronlar ile ikincil antikor immunolabeling giderir. Ancak, tüm rutin olarak kullanılan türevleri tahlil için izleyiciler Protokolü ihtiyaçlarınıza uyum için size şans vermek amacıyla tartışma bizim bakın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Orada üç deneyleri rutin olarak sinaptik vezikül (SV) geri dönüşüm çalışırdım. İlk iki kullanımını içerecek bir) Floresan styryl Boyayıcılar FM1-(hangi organelleri endositoz sırasında alınır ve ekzositozu sonra yayımlanan membranlar dahil) 43 gibi; ve b) fluorescently rekombinant SV proteinler (ki, overexpression proteinaceous geri dönüşüm makineleri dahil) öğesini. Ekli fluorophores onların floresans pH bağlı olarak değiştirirseniz, bir SV asidik iç ve ekstraselüler ortamın pH aras?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Irmgard Weiss uzman teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser DFG kümenin mikroskobu nanometre mesafeden için mükemmel ve moleküler fizyolojisi (CNMPB, B1-7, T.D.) beyin üzerinden tarafından desteklenmiştir.
Materials
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BSA | Sigma | A7030-50g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306-100g | |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | ||
| dH2O | Invitrogen | 15230 | |
| DABCO | Merck | 8.03456.0100 | |
| donkey anti mouse Alexa 647 | Jackson-Immunoresearch | 715605151 | antibody |
| DMEM | Invitrogen | 41966 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| tube (50 mL) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| FBS superior | BiochromAG | S0615 | |
| Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170 | |
| HEPES | Sigma | H4034-500g | |
| Hera Cell 150 (Inkubator) | ThermoElectron Corporation | ||
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541-500g | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030 | |
| MgCl2 | Honeywell | M0250-500g | |
| microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| OpenView Experiment Analysis Application | Free software, see comments | written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Optimem | Invitrogen | 31985 | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| safety hood | ThermoElectron | Serial No. 40649111 | |
| Sucrose | neoFroxx | 1104kg001 | |
| Synaptotagmin1 | Synaptic Systems | 105311 | mouse monoclonal; clone 604.2 |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Water bath | GFL | 1004 | |
| Zeiss Observer. Z1 | Zeiss | ||
Referencias
- Koh, T., Bellen, H. J. Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release. Trends in Neurosciences. 26, 413-422 (2003).
- Chapman, E. R. How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release. Annual Review of Biochemistry. 77, 615-641 (2008).
- Perin, M. S., et al. Structural and Functional Conservation of Synaptotagmin (p65) in Drosophila and Humans. Journal of Biological Chemistry. 266, 615-622 (1991).
- Matteoli, M., Takei, K., Perrin, M. S., Südhof, T. C., De Camilli, P. Exo-endocytotic Recycling of Synaptic Vesicles in Developing Processes of Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Cell Biology. 117, 849-861 (1992).
- Ko, J., et al. Neuroligin-1 performs neurexin-dependent and neurexin-independent functions in synapse validation. The EMBO Journal. 28, 3244-3255 (2009).
- Shinoda, Y., et al. BDNF enhances spontaneous and activity-dependent neurotransmitter release at excitatory terminals but not at inhibitory terminals in hippocampal neurons. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 27 (2014).
- Ivanova, D., et al. Synaptic activity controls localization and function of CtBP 1 via binding to Bassoon and Piccolo. The EMBO Journal. 34, 1056-1077 (2015).
- Crawford, D. C., Ramirez, D. M. O., Trauterman, B., Monteggia, L. M., Kavalali, E. T. Selective molecular impairment of spontaneous neurotransmission modulates synaptic efficacy. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Riemann, D., Wallrafen, R., Dresbach, T. The Kohlschütter-Tönz syndrome associated gene Rogdi encodes a novel presynaptic protein. Scientific Reports. 7, (2017).
- Kim, M., et al. Rogdi Defines GABAergic Control of a Wake-promoting Dopaminergic Pathway to Sustain Sleep in Drosophila. Scientific Reports. 7, 1-14 (2017).
- Schossig, A., Wolf, N. I., Kapferer, I., Kohlschütter, A., Zschocke, J. Epileptic encephalopathy and amelogenesis imperfecta: Kohlschütter-Tönz syndrome. Euopean Journal of Medical Genetics. 55, 319-322 (2012).
- Kraszewski, K., et al. Synaptic Vesicle Dynamics in Living Cultured Hippocampal Neurons Visualized with CY3-Conjugated Antibodies Directed against the Lumenal Domain of Synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15, 4328-4342 (1995).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Petkova, A., Goedecke, N., Korte, M., Dresbach, T. Neuroligins mediate presynaptic maturation through brain-derived neurotrophic factor signaling. bioRxiv. , 262246 (2018).
- Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. European Journal of Neuroscience. 38, 3146-3158 (2013).
- Dresbach, T., et al. Functional regions of the presynaptic cytomatrix protein Bassoon: Significance for synaptic targeting and cytomatrix anchoring. Molecular and Cellular Neuroscience. 23, 279-291 (2003).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice. Journal of Visualized Experiments. (65), 4-9 (2012).
- Tsuriel, S., et al. Local sharing as a predominant determinant of synaptic matrix molecular dynamics. PLOS Biology. 4, 1572-1587 (2006).
- Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-10 (2014).
- Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), 1-8 (2017).
- Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nature Neuroscience. 17, 10-16 (2014).
- Opazo, F., et al. Limited Intermixing of Synaptic Vesicle Components upon Vesicle Recycling. Traffic. 11, 800-812 (2010).
- Wollebo, H. S., Woldemichaele, B., White, M. K. Lentiviral transduction of neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1078, 141-146 (2013).
- Yang, X., Kaeser-Woo, Y. J., Pang, Z. P., Xu, W., Südhof, T. C. Complexin Clamps Asynchronous Release by Blocking a Secondary Ca2+ Sensor via Its Accessory α Helix. Neuron. 68, 907-920 (2010).
- Wittenmayer, N., et al. Postsynaptic Neuroligin1 regulates presynaptic maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13564-13569 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive Remodeling of the Presynaptic Cytomatrix upon Homeostatic Adaptation to Network Activity Silencing. Journal of Neuroscience. 31, 10189-10200 (2011).
- Kraszewski, K., Daniell, L., Mundigl, O., De Camilli, P. Mobility of synaptic vesicles in nerve endings monitored by recovery from photobleaching of synaptic vesicle-associated fluorescence. Journal of Neuroscience. 16, 5905-5913 (1996).
- Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nature Neuroscience. 13, 1451-1453 (2010).
- Han, W., et al. N-Glycosylation Is Essential for Vesicular Targeting of Synaptotagmin 1. Neuron. 41, 85-99 (2004).
- Kwon, S. E., Chapman, E. R. Glycosylation is dispensable for sorting of synaptotagmin 1 but is critical for targeting of SV2 and synaptophysin to recycling synaptic vesicles. Journal of Biological Chemistry. 287, 35658-35668 (2012).
- Afuwape, O. A. T., Wasser, C. R., Schikorski, T., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle pool-specific modification of neurotransmitter release by intravesicular free radical generation. The Journal of Physiology. 595, 1223-1238 (2017).
- Sara, Y., Virmani, T., Deák, F., Liu, X., Kavalali, E. T. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
- Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nature Neuroscience. 13, 1454-1456 (2010).
- Bacci, A., et al. Chronic blockade of glutamate receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated membrane protein 2. Journal of Neuroscience. 21, 6588-6596 (2001).
- Piccoli, G., et al. LRRK2 Controls Synaptic Vesicle Storage and Mobilization within the Recycling Pool. Journal of Neuroscience. 31, 2225-2237 (2011).
- Tracy, T. E., Yan, J. J., Chen, L. Acute knockdown of AMPA receptors reveals a trans-synaptic signal for presynaptic maturation. The EMBO Journal. 30, 1577-1592 (2011).
- Truckenbrdot, S., Viplav, A., Jaehne, S., Vogts, A., Denker, A., Wildhagen, H., Fornasiero, E. F., Rizzoli, S. O. Ageing synaptic vesicles are inactivated by contamination with SNAP25. bioRxiv. , 172239 (2017).
