De generatie van gesloten femorale fracturen in muizen: een Model om te studeren bot genezing
Summary
Het model lymfkliertest gesloten femurfractuur is een krachtig platform om te studeren fractuur genezing en nieuwe therapeutische strategieën te bot regeneratie te versnellen. Het doel van deze chirurgische protocol is het genereren van unilaterale gesloten femorale fracturen in muizen met behulp van een intramedullaire stalen staaf te stabiliseren van het dijbeen.
Abstract
Botbreuken leggen een enorme sociaal-economische last voor de patiënten, naast de aanzienlijke invloed zijn op hun kwaliteit van leven. Therapeutische strategieën die efficiënte bot genezing te bevorderen zijn non-existent en in hoge vraag. Effectieve en reproduceerbare diermodellen van fracturen genezing zijn nodig om te begrijpen van de complexe biologische processen gekoppeld aan bot regeneratie. Veel dierlijke modellen van breuk genezing zijn gegenereerd door de jaren heen; echter lymfkliertest fractuur modellen hebben onlangs naar voren gekomen als krachtige tools om te studeren bot genezing. Een verscheidenheid van open en gesloten modellen zijn ontwikkeld, maar het model gesloten femurfractuur onderscheidt zich als een eenvoudige methode voor het genereren van snelle en reproduceerbare resultaten in een fysiologisch relevante wijze. Het doel van deze chirurgische protocol is voor het genereren van unilaterale gesloten femorale fracturen bij muizen en een stabilisatie na fractuur van het dijbeen vergemakkelijken door het invoegen van een intramedullaire stalen staaf. Hoewel apparaten zoals een spijker of een schroef grotere axiale en rotatie stabiliteit bieden, biedt het gebruik van een staaf intramedullaire een voldoende stabilisatie voor consistente resultaten van genezing zonder nieuwe gebreken in het botweefsel te produceren of in de buurt van zachte schadelijk weefsel. Radiografische beeldvorming gebruikt voor het bewaken van de voortgang van eelt vorming, bony Unie en latere verbouwing van de benige callus. Bot helende resultaten zijn meestal gekoppeld aan met de kracht van het genezen been en gemeten met torsional testen. Toch is van cruciaal belang in de studie van bot weefselregeneratie inzicht in de vroege cellulaire en moleculaire gebeurtenissen fractuur reparatie is gekoppeld. Het model gesloten Femurfractuur bij muizen met intramedullaire fixatie fungeert als een aantrekkelijk platform om te bestuderen bot fractuur genezing en evalueren van therapeutische strategieën om te versnellen van de genezing.
Introduction
Fracturen behoren tot de meest voorkomende verwondingen voorkomende aan het houdings-en bewegingsapparaat en zijn gekoppeld aan een enorme sociaal-economische last, met inbegrip van de behandelingskosten die naar verwachting overtreffen van 25 miljard dollar per jaar in de Verenigde Staten1, 2. Hoewel de meerderheid van de breuken zonder incidenten genezen, wordt genezing geassocieerd met aanzienlijke uitvaltijd en productiviteitsverlies. Ongeveer 5-10% van alle fracturen leiden tot een vertraagde genezing of niet-Unie, als gevolg van leeftijd of andere onderliggende chronische aandoeningen, zoals osteoporose en diabetes mellitus3,4,5. Geen FDA-goedgekeurde farmacologische behandelingen zijn momenteel beschikbaar voor de bevordering van efficiënte bot genezing en hersteltijd te verkorten.
Fractuur genezing is een complex en zeer dynamisch proces met betrekking tot de coördinatie van meerdere celtypen. Een grondig inzicht in de cellulaire en moleculaire gebeurtenissen die zijn gekoppeld aan bot regeneratie is dus cruciaal voor de identificatie van therapeutische doelen die dit proces versnellen. Zoals met andere ziekten bij de mens is de oprichting van een zeer vatbaar en reproduceerbare diermodel cruciaal in de studie van het bot genezing. Grotere dieren, zoals schapen en varkens, hebben bot remodelleert eigenschappen en biomechanica vergelijkbaar voor de mens, maar zijn duur, vereisen aanzienlijke genezing tijd, en zijn niet gemakkelijk vatbaar voor genetische manipulatie6. Aan de andere kant, bieden kleine dierlijke modellen, zoals ratten en muizen, veel voordelen, waaronder een gebruiksgemak, lage kosten van onderhoud, korte fok cycli, en een kortere helende tijd7verwerken. Bovendien, het genoom van de muis is gesequenced, rekening houdend met de snelle manipulatie en de generatie van genetische varianten. De muis is dus een krachtig modelsysteem om te studeren ziekten bij de mens, letsel, en8herstellen. Bij de mens vergroot comorbidities zoals osteoporose en diabetes mellitus u de kans van een vertraagde genezing. Een aantal bestaande Muismodellen zijn beschikbaar voor de studie van de effecten van comorbidities zoals osteoporose en diabetes mellitus op letsel van het bot en genezing. Patiënten die lijden aan osteoporose hebben een sterk verminderde biomineralisatie tijdens de latere stadia van een fractuur genezing9. Ovariectomized (OVX) muizen vertonen snelle botverlies en vertraagde bot genezing vergelijkbaar met die bij postmenopauzale osteoporose10,11waargenomen. Bovendien vele Muismodellen van type I en type II diabetes bootsen de lage bot massa fenotypes en verminderde fractuur genezing gezien in mens11. Bovendien lymfkliertest fractuur modellen dienen als een veelzijdig platform om te bestuderen van de complexe biologische processen die zich voordoen in de eelt en verkennen van nieuwe therapeutische strategieën die bot weefselregeneratie versnellen.
Ondanks verschillen in botstructuur en metabolisme, het gehele proces van genezing blijft zeer vergelijkbaar in muizen en mensen, botbreuk waarbij een combinatie van endochondral en intramembranous ossificatie gevolgd door bot remodelleren. Endochondral ossificatie omvat de werving van voorlopercellen mechanisch minder stabiele regio’s rondom de breuk kloof, waar zij onderscheid in chondrocyten die hypertrofie en mineralize van het kraakbeen om te produceren een zachte callus. De tweede golf van voorlopercellen infiltreren de eelt en onderscheid maken in volwassen botcellen die nieuw bot matrix12,13,14,15afscheiden. Tijdens intramembranous ossificatie, progenitoren op de periosteal en endosteale oppervlakken direct onderscheid in matrix afscheidende botcellen en vergemakkelijken de overbrugging van de fractuur kloof9,11,12 ,,13. Samen, de endochondral en intramembranous ossifications leiden tot de ontwikkeling van een hard eelt, die verder in de tijd tot het vormen van een sterke secundaire bone beeldschermresolutie ondersteunen mechanische belastingen13,14 is vernieuwd ,15. Bij de gezonde mens duurt het genezingsproces ongeveer 3 maanden, vergeleken met slechts 35 dagen in muizen16.
Fractuur genezing is vaak bestudeerd met behulp van een open of gesloten chirurgische modellen17. Open chirurgische benaderingen, zoals het genereren van een kritisch formaat defect of complete osteotomie, standaardisering van de locatie van het letsel en de geometrie om afwijkingen veroorzaakt door verbrijzelde fracturen. Osteotomieën dienen als een uitstekend model te bestuderen van het onderliggende mechanisme is erachter een non-adhesie omdat genezing is vaak vertraagd in vergelijking met gesloten fracturen. Bovendien is een rigide externe fixatie nodig om te stabiliseren van het osteotomized bot, wat betekent dat de regeneratie zal voornamelijk afhangen van de intramembranous ossificatie. Open chirurgische benaderingen gebruiken apparaten zoals vergrendeling nagels, pin-videoclips en vergrendeling platen zodat axiale en rotatie stabiliteit aan de gebroken ledematen; echter, deze apparaten zijn duur en vereisen aanzienlijk meer tijd in chirurgie18,19,20,21. Aan de andere kant, zijn gesloten modellen gestabiliseerd met een eenvoudige intramedullaire fixatie inrichting, waarmee voor voldoende instabiliteit te stimuleren endochondral genezing. Dientengevolge, gesloten fractuur modellen doen niet gemakkelijk na te bootsen de voorwaarden van een niet-Unie. Inwendige fixatie technieken, zoals intramedullaire pinnen, nagels en COMPRESSIESCHROEVEN, zijn voordelig, zoals ze goedkoop, makkelijk te gebruiken zijn, en het minimaliseren van de tijd in chirurgie21,22,23. In sommige gevallen intramedullaire pins worden ingevoegd vóór de breuk, maar het buigen van de intramedullaire pin kan leiden tot de gehoekt of verplaatsing van het gebroken dijbeen, bij te dragen tot de grootte van een variabele eelt en genezing. De locatie van de breuk en de geometrie zijn moeilijker te standaardiseren in gesloten modellen, zoals ze worden gegenereerd met behulp van een drie-punt buigende apparaat, waarin een gewicht wordt neergezet op de diaphysis. Echter, met de juiste techniek, deze chirurgische aanpak biedt snelle en consistente resultaten. Bovendien dient het model gesloten fractuur als een klinisch relevante instrument om te studeren fracturen veroorzaakt door de impact van de hoge kracht of mechanische spanning22.
Dit chirurgische protocol werd aangepast van de eerder beschreven methoden met behulp van een pin intramedullaire te stabiliseren gebroken dijbeen bij ratten en muizen22,24,25. Eerst een intramedullaire naald met een kleine diameter wordt ingebracht via de inkeping van de intracondylar om een punt van binnenkomst, en een guidewire wordt ingevoerd voorafgaand aan het genereren van een dwarse breuk aan het femur midshaft met behulp van een drie-punt van de zwaartekracht-afhankelijke buigmoment apparaat. Na de succesvolle generatie van een gesloten femurfractuur, een intramedullaire roede van een grotere diameter wordt opgenomen over de begeleidingskabel aan het stabiliseren van de gebroken dijbeen. Deze methode voorkomt het risico op vertraagde genezing veroorzaakt door de gehoekt van de intramedullaire pin tijdens de breuk, omdat de plaatsing van de staaf na breuk voor de herpositionering en geoptimaliseerde stabilisatie van de gewonde dijbeen zorgt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van deze chirurgische ingreep is het genereren van gestandaardiseerde gesloten femorale fracturen in muizen. Een belangrijk voordeel van dit model is dat de interne fixatie na de generatie van de breuk plaatsvindt, waardoor het vermijden van een gehoekt van de intramedullaire staaf. Misschien is het meest kritieke aspect van dit protocol is de generatie van een gestandaardiseerde dwarse breuk aan het femur midshaft, zoals de geometrie van de breuk is afhankelijk van de toegepaste buigende kracht en de positioner…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van de Department of Defense (DoD) ons leger medisch onderzoek en materieel commando (USAMRMC) Congressionally gericht medisch onderzoek programma’s (CDMRP) (PR121604) en de nationale instituten van artritis en Musculoskeletal en ziekten (NIAMS), NIH R01 AR068332 naar Uma Sankar huid.
Materials
| Oster Minimax Trimmer | Animal World Network | 78049-100 | |
| POVIDONE-IODINE | Thermo Fisher Scientific | 395516 | |
| OPHTHALMIC OINTMENT | Thermo Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Styker T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific Corporation | TP-700 | |
| 1ml Sub-Q Syringe | Thermo Fisher Scientific | 309597 | |
| ENCORE Sensi-Touch PF | Moore Medical LLC | 30347 | Latex, powder-free surgical glove |
| PrecisionGlide 25G Hypodermic Needles | Thermo Fisher Scientific | 14-826-49 | |
| Ultra-High-Temperature Tungsten Wire, | McMaster-Carr | 3775K37 | 0.005" Diameter, 1/16 lb. Spool, 380' Long |
| 304 stainless steel, 24G thin walled tubing | Microgroup Inc | 304h24tw-5ft | |
| #15 Scalpel Blades | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| #10 Scalpel Blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | Serrated/Straight/12cm |
| Iris Forceps | Fine Science Tools | 11066-07 | 1×2 Teeth/Straight/7cm |
| Dissector Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Slim Blades/Angled to Side/Sharp-Sharp/10cm |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | ToughCut/Straight/Sharp-Sharp/11.5cm |
| Olsen-Hegar Needle Holder with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-12 | Straight/Serrated/12cm/with Lock |
| Crile Hemostat | Fine Science Tools | 13004-14 | Serrated/Straight/14cm |
| Tungsten Wire Cutter | ACE Surgical Supply Co., Inc. | 08-051-90 | ACE #150 Wire Cutter, tungsten carbide tips |
| 3-0 VICRYL Suture | Ethicon Suture | J423H | 3-0 VICRYL UNDYED 27" FS-2 CUTTING |
| piXarray 100 Digital Specimen Radiography System | Bioptics, Inc | Cabinet x-ray system | |
| Einhorn 3-Point Bending Device | N/A | N/A | Custom Built |
Referencias
- Schnell, S., Friedman, S. M., Mendelson, D. A., Bingham, K. W., Kates, S. L. The 1-Year Mortality of Patients Treated in a Hip Fracture Program for Elders. Geriatric Orthopaedic Surgery & Rehabilitation. 1 (1), 6-14 (2010).
- Burge, R., et al. Incidence and economic burden of osteoporosis-related fractures in the United States, 2005-2025. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (3), 465-475 (2007).
- Cunningham, B. P., Brazina, S., Morshed, S., Miclau, T. Fracture healing: A review of clinical, imaging and laboratory diagnostic options. Injury. 48, S69-S75 (2017).
- Einhorn, T. A. Can an anti-fracture agent heal fractures?. Clinical Cases in Mineral and Bone Metabolism. 7 (1), 11-14 (2010).
- Hak, D. J., et al. Delayed union and nonunions: epidemiology, clinical issues, and financial aspects. Injury. 45, S3-S7 (2014).
- Decker, S., Reifenrath, J., Omar, M., Krettek, C., Muller, C. W. Non-osteotomy and osteotomy large animal fracture models in orthopedic trauma research. Orthopaedic Reviews (Pavia). 6 (4), 5575 (2014).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Jacenko, O., Olsen, B. R. Transgenic mouse models in studies of skeletal disorders. Journal of Rheumatology Supplement. 43, 39-41 (1995).
- Nikolaou, V. S., Efstathopoulos, N., Kontakis, G., Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. The influence of osteoporosis in femoral fracture healing time. Injury. 40 (6), 663-668 (2009).
- Bain, S. D., Bailey, M. C., Celino, D. L., Lantry, M. M., Edwards, M. W. High-dose estrogen inhibits bone resorption and stimulates bone formation in the ovariectomized mouse. Journal of Bone and Mineral Research. 8 (4), 435-442 (1993).
- Haffner-Luntzer, M., Kovtun, A., Rapp, A. E., Ignatius, A. Mouse Models in Bone Fracture Healing Research. Current Molecular Biology Reports. 2 (2), 101-111 (2016).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews in Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Seminar in Cellular and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).
- Ai-Aql, Z. S., Alagl, A. S., Graves, D. T., Gerstenfeld, L. C., Einhorn, T. A. Molecular mechanisms controlling bone formation during fracture healing and distraction osteogenesis. Journal of Dental Research. 87 (2), 107-118 (2008).
- Gerstenfeld, L. C., et al. Three-dimensional Reconstruction of Fracture Callus Morphogenesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (11), 1215-1228 (2006).
- Marsell, R., Einhorn, T. A. Emerging bone healing therapies. Journal of Orthopaedic Trauma. 24, S4-S8 (2010).
- Lybrand, K., Bragdon, B., Gerstenfeld, L. Mouse models of bone healing: fracture, marrow ablation, and distraction osteogenesis. Current Protocols of Mouse Biology. 5 (1), 35-49 (2015).
- Garcia, P., et al. The LockingMouseNail–a new implant for standardized stable osteosynthesis in mice. Journal of Surgical Research. 169 (2), 220-226 (2011).
- Histing, T., et al. An internal locking plate to study intramembranous bone healing in a mouse femur fracture model. Journal of Orthopaedic Research. 28 (3), 397-402 (2010).
- Garcia, P., et al. A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing. Journal of Biomechistry. 41 (8), 1689-1696 (2008).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23 (5 Suppl), S31-S38 (2009).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Holstein, J. H., Menger, M. D., Culemann, U., Meier, C., Pohlemann, T. Development of a locking femur nail for mice. Journal of Biomechistry. 40 (1), 215-219 (2007).
- McBride-Gagyi, S. H., McKenzie, J. A., Buettmann, E. G., Gardner, M. J., Silva, M. J. Bmp2 conditional knockout in osteoblasts and endothelial cells does not impair bone formation after injury or mechanical loading in adult mice. Bone. 81, 533-543 (2015).
- Williams, J. N., et al. Inhibition of CaMKK2 Enhances Fracture Healing by Stimulating Indian Hedgehog Signaling and Accelerating Endochondral Ossification. Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).
