La génération des Fractures fémorales fermées chez la souris : un modèle pour étudier la guérison osseuse

Summary

Le modèle murin fracture fémorale fermée est une plateforme puissante pour étudier la guérison des fractures et nouvelles stratégies thérapeutiques pour accélérer la régénération osseuse. L’objectif de ce protocole chirurgical est de générer des fractures fémorales fermées unilatérales chez la souris à l’aide d’une tige intramédullaire en acier pour stabiliser le fémur.

Abstract

Fractures osseuses imposent un énorme fardeau socio-économique pour les patients, en plus d’affecter considérablement leur qualité de vie. Les stratégies thérapeutiques qui favorisent la guérison osseuse efficace sont inexistants et très en demande. Efficaces et reproductibles des modèles animaux de fractures de guérison sont nécessaires pour comprendre les processus biologiques complexes associées à la régénération osseuse. Nombreux modèles animaux de la guérison des fractures ont été générés au cours des années ; Cependant, des modèles murins de fracture ont récemment émergé comme des outils puissants pour étudier la guérison osseuse. Une variété de modèles ouverts et fermés ont été développées, mais le modèle de fracture fémorale fermée s’impose comme une méthode simple pour générer des résultats rapides et reproductibles de façon physiologiquement pertinente. L’objectif de ce protocole chirurgical consiste à générer des fractures fémorales fermées unilatérales chez la souris et de faciliter une stabilisation après fracture du fémur en insérant une tige intramédullaire en acier. Bien que les dispositifs comme un clou ou une vis offrent une plus grande stabilité axiale et de rotation, l’utilisation d’une tige intramédullaire fournit une stabilisation suffisante pour les résultats de guérison uniformes sans produire de nouveaux défauts dans le tissu osseux ou d’endommager à proximité de soft tissus. L’imagerie radiographique est utilisé pour surveiller la progression de la formation de cals, consolidation osseuse et ultérieures de remodelage du cal osseux. Résultats de guérison osseuse sont généralement associées à la force de l’os cicatrisé et mesurés avec l’essai de torsion. Pourtant, comprendre les premiers événements cellulaires et moléculaires associés à la réparation de la fracture est critique dans l’étude de la régénération des tissus osseux. Le modèle fermé fracture fémorale chez les souris avec fixation intramédullaire sert une plate-forme attrayante pour étudier la guérison des fractures osseuses et d’évaluer des stratégies thérapeutiques pour accélérer la guérison.

Introduction

Les fractures sont parmi les blessures les plus courantes qui se produisent à l’appareil locomoteur et sont associés à un énorme fardeau socio-économique, y compris les frais de traitement qui devraient pour dépasser les $ 25 milliards par an dans les États-Unis^{1, 2}. Bien que la majorité des fractures guérissent sans incident, la guérison est associée à des interruptions de service importante et perte de productivité. Environ 5 à 10 % de toutes les fractures aboutissent à une guérison retardée ou le non syndiqués, en raison d’âge ou d’autres conditions de santé chronique sous-jacente, tels que l’ostéoporose et le diabète sucré^3,4,5. Aucun traitement pharmacologique n’approuvé par la FDA est actuellement disponible pour favoriser la guérison osseuse efficace et raccourcir le temps de récupération.

Guérison des fractures est un processus complexe et très dynamique impliquant la coordination de plusieurs types de cellules. Une compréhension globale des événements cellulaires et moléculaires associés à la régénération osseuse est donc important d’identifier des cibles thérapeutiques qui permettent d’accélérer ce processus. Comme pour d’autres maladies humaines, la mise en place d’un modèle animal très favorable et reproductible est cruciale dans l’étude de la guérison osseuse. Des animaux plus gros comme les moutons et les porcs, ont des propriétés de remodelage osseux et biomécanique semblables aux humains, mais sont chers, exigent des temps de guérison important et ne prêtent pas facilement à des manipulations génétiques⁶. En revanche, petits modèles animaux, tels que les rats et les souris, offrent de nombreux avantages, notamment une facilité de manipulation, de faibles coûts d’entretien, les cycles de reproduction court et une guérison plus court délai⁷. En outre, le génome de la souris est séquencé, ce qui permet la génération des variants génétiques et la manipulation rapide. Ainsi, la souris est un système puissant modèle pour étudier les maladies humaines, les blessures et réparer les⁸. Chez l’homme, maladies concomitantes comme le diabète sucré et de l’ostéoporose augmentent la probabilité d’une guérison retardée. Un certain nombre de modèles de souris existants est disponibles pour étudier les effets des comorbidités telles que l’ostéoporose et le diabète sucré sur les lésions osseuses et guérison. Les patients souffrant d’ostéoporose ont une ossification nettement diminué durant les derniers stades d’une fracture⁹de guérison. Ovariectomisées (OVX) souris présentent une perte osseuse rapide et retardée osseuse guérison similaire à celle observée dans l’ostéoporose postménopausique^10,11. En outre, de nombreux modèles de souris de type I et diabète de type II imitent les phénotypes masse osseuse faible et la guérison des fractures altérée chez les humains,¹¹. En outre, les modèles murins fracture servent une plateforme polyvalente pour étudier les processus biologiques complexes qui se produisent dans le CAL et explorent de nouvelles stratégies thérapeutiques qui accélèrent la régénération des tissus osseux.

Malgré les différences dans la structure osseuse et le métabolisme, l’ensemble du processus de fracture osseuse guérison reste très similaire chez les souris et les humains, comportant une combinaison d’endochondral et ossification intramembranaires suivie de remodelage osseux. L’ossification endochondrale implique le recrutement de cellules progénitrices aux régions moins mécaniquement stables autour de l’écart de la fracture, où ils se différencient en chondrocytes qui l’hypertrophie et minéraliser le cartilage pour produire un cal mou. La deuxième vague de cellules progénitrices infiltrer les cals et se différencient en ostéoblastes matures qui sécrètent le nouvel OS matrice^12,13,14,15. Au cours de l’ossification intramembranaires, progéniteurs sur les surfaces du périoste et endostique directement se différencient en matrice sécrétant des ostéoblastes et facilitent le comblement de la fracture écart^{9,11,12 ,},¹³. Ensemble, l’os endochondral et ossifications intramembranaires déboucher sur l’élaboration d’un cal dur, qui est également remodelé au fil du temps pour former un osseuse secondaire solide capable de supporter des charges mécaniques^{13,14 ,15}. Chez l’homme sain, le processus de guérison prend environ 3 mois, comparées à seulement 35 jours en souris¹⁶.

Guérison des fractures a souvent étudiée en utilisant soit des modèles chirurgicale ouverte ou fermée¹⁷. Ouvrez les approches chirurgicales, telles que la génération d’un défaut de taille critique ou compléter ostéotomie, normaliser la localisation de la lésion et la géométrie pour réduire les écarts causés par des fractures comminutives. Ostéotomies servent un excellent modèle pour étudier le mécanisme sous-jacent derrière un déboîtement car la guérison est souvent retardée par rapport aux fractures fermées. En outre, une fixation rigide externe est nécessaire pour stabiliser l’OS osteotomized, ce qui signifie que la régénération dépendra principalement de l’ossification intramembranaires. Les approches chirurgicales ouvertes utilisent périphériques tels que les clous verrouillage pin-clips et gâches pour assurer la stabilité axiale et de rotation pour le membre fracturé ; Toutefois, ces appareils sont coûteux et nécessitent beaucoup plus de temps dans la chirurgie^18,19,20,21. En revanche, les modèles fermés sont stabilisées avec un dispositif de fixation simple intramédullaire, permettant suffisamment instabilité stimuler la guérison endochondrale. Ainsi, les modèles de fracture fermée imite pas facilement les conditions d’un déboîtement. Techniques de fixation interne, tels qu’intramédullaire épingles, clous et vis de compression, sont avantageux car ils sont bon marché, facile à utiliser et minimiser le temps en chirurgie^21,22,23. Dans certains cas, intramédullaire broches sont insérées avant la rupture, mais la flexion de la tige intramédullaire peut conduire à l’angulation ou déplacement du fémur fracturé, contribuant à une taille variable de cals et de guérison. L’emplacement de la fracture et la géométrie sont plus difficiles à standardiser les modèles fermés, telles qu’elles sont créées à l’aide d’un dispositif de flexion trois points, dans lequel un poids est tombé sur la diaphyse. Cependant, avec la bonne technique, cette approche chirurgicale offre des résultats rapides et constants. En outre, le modèle de fracture fermée sert d’outil cliniquement pertinent pour l’étude des fractures causées par l’impact de grande force ou stress mécanique²².

Ce protocole chirurgical est une adaptation de méthodes précédemment décrites à l’aide d’une tige intramédullaire pour stabiliser la fracture fémur chez le rat et la souris^22,24,25. Tout d’abord, une aiguille intramédullaire de petit diamètre est insérée dans l’encoche de l’intracondylar d’établir un point d’entrée, et un fil-guide est introduit avant de générer une rupture transversale à la mi-diaphyse fémorale à l’aide d’une gravité dépendante trois-points dispositif de pliage. À la suite de la génération réussie d’une fracture fermée du fémur, une tige intramédullaire d’un plus grand diamètre est incorporée sur le guide métallique pour stabiliser le fractures du fémur. Cette méthode permet d’éviter les risques de cicatrisation retardée causée par l’angulation de la tige intramédullaire lors de la rupture, car le placement de la fracture de la tige permet la stabilisation de repositionnement et optimisée du fémur lésée.

Protocol

La procédure suivante a été réalisée avec l’approbation de l’Indiana University School of Medicine institutionnels Animal Care et utilisation Comité (IACUC). Toutes les chirurgies de survie ont été effectuées dans des conditions stériles, tels que décrits par les NIH guidelines. Douleur et risque d’infections ont été gérés avec bon analgésiques et d’antibiotiques pour assurer une issue positive. 1. anesthésie et préparation Peser la souris et il anesthésier…

Representative Results

La mise en œuvre réussie de cette intervention chirurgicale a été suivie avec l’imagerie radiographique. Étapes clés incluent l’insertion d’une aiguille intramédullaire, le placement d’un fil-guide, l’induction d’une rupture transversale à la mi-diaphyse fémorale et la stabilisation correcte avec une tige intramédullaire (Figure 2 aje – 2Aiv). La progression de guérison de la Cal de fracture a été sui…

Discussion

L’objectif de cette intervention chirurgicale est de générer des fractures fémorales fermées normalisées chez la souris. Un avantage majeur de ce modèle est que la fixation interne a lieu après la génération de la fracture, évitant ainsi une angulation de la tige intramédullaire. Peut-être l’aspect le plus important de ce protocole est la génération d’une rupture transversale standardisée à la mi-diaphyse fémorale, comme la géométrie de la fracture dépend de la force de flexion appliquée et le …

Materials

Oster Minimax Trimmer	Animal World Network	78049-100
POVIDONE-IODINE	Thermo Fisher Scientific	395516
OPHTHALMIC OINTMENT	Thermo Fisher Scientific	NC0490117
Styker T/Pump Warm Water Recirculator	Kent Scientific Corporation	TP-700
1ml Sub-Q Syringe	Thermo Fisher Scientific	309597
ENCORE Sensi-Touch PF	Moore Medical LLC	30347	Latex, powder-free surgical glove
PrecisionGlide 25G Hypodermic Needles	Thermo Fisher Scientific	14-826-49
Ultra-High-Temperature Tungsten Wire,	McMaster-Carr	3775K37	0.005" Diameter, 1/16 lb. Spool, 380' Long
304 stainless steel, 24G thin walled tubing	Microgroup Inc	304h24tw-5ft
#15 Scalpel Blades	Fine Science Tools	10015-00
#10 Scalpel Blades	Fine Science Tools	10010-00
Narrow Pattern Forceps	Fine Science Tools	11002-12	Serrated/Straight/12cm
Iris Forceps	Fine Science Tools	11066-07	1×2 Teeth/Straight/7cm
Dissector Scissors	Fine Science Tools	14081-09	Slim Blades/Angled to Side/Sharp-Sharp/10cm
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11	ToughCut/Straight/Sharp-Sharp/11.5cm
Olsen-Hegar Needle Holder with Suture Cutter	Fine Science Tools	12002-12	Straight/Serrated/12cm/with Lock
Crile Hemostat	Fine Science Tools	13004-14	Serrated/Straight/14cm
Tungsten Wire Cutter	ACE Surgical Supply Co., Inc.	08-051-90	ACE #150 Wire Cutter, tungsten carbide tips
3-0 VICRYL Suture	Ethicon Suture	J423H	3-0 VICRYL UNDYED 27" FS-2 CUTTING
piXarray 100 Digital Specimen Radiography System	Bioptics, Inc		Cabinet x-ray system
Einhorn 3-Point Bending Device	N/A	N/A	Custom Built