Methoden zur Bewertung der Rolle von c-Fos und Dusp1 in Abhängigkeit der Onkogen
Summary
Hier beschreiben wir Protokolle für die genetischen und chemischen Validierung von c-Fos und Dusp1 als Medikament Ziel bei Leukämie mit in vitro und in vivo genetische und humanisierte Mausmodelle. Diese Methode kann auf jedes beliebige Ziel für genetische Validierung und therapeutische Entwicklung angewendet werden.
Abstract
Die Demonstration der Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKIs) bei der Behandlung von chronisch-myeloischer Leukämie (CML) hat eine neue Ära in der Krebstherapie eingeläutet. Jedoch reagiert eine kleine Population von Zellen nicht auf TKI Behandlung, was zu minimaler Resterkrankung (MRD); auch die potenten TKIs scheitern, diese Zellen zu beseitigen. Diese MRD-Zellen dienen als Reservoir Resistenz gegen Therapie entwickeln. Warum TKI Behandlung gegen MRD Zellen unwirksam ist, ist nicht bekannt. Growth Factor Signalisierung unterstützt das Überleben der MRD-Zellen während der TKI Behandlung verwickelt ist, aber ein mechanistisches Verständnis fehlt. Jüngste Studien gezeigt, dass erhöhte c-Fos und Dusp1 Ausdruck durch konvergente onkogenen und Wachstumsfaktor Signalisierung in MRD Zellen TKI-Resistenz zu vermitteln. Die genetische und chemische Hemmung der c-Fos und Dusp1 CML exquisit empfindlich auf TKIs macht und heilt CML in beide genetischen und humanisierte Mausmodelle. Wir identifizieren dieser Zielgene mit mehreren Microarrays von TKI-empfindlichen und -resistente Zellen. Hier bieten wir Methoden zur Target-Validierung mit in vitro und in vivo Mausmodellen. Diese Methoden können leicht auf jedes Ziel für genetische Validierung und therapeutische Entwicklung angewendet werden.
Introduction
Konstitutive Tyrosin-Kinase-Aktivität von BCR-ABL1 Fusion Onkogen verursacht CML, sorgt für eine Begründung um die Kinase-Aktivität von niedermolekularer Hemmer ansprechen. Der Erfolg von TKIs bei der Behandlung von CML-Patienten revolutioniert das Konzept der gezielten Therapie1,2. Anschließend entwickelte Anti-Kinase-Therapie als Präzisionsmedizin für mehrere andere Malignome, einschließlich der solide Tumoren. Bisher sind mehr als dreißig Kinase-Inhibitoren von der United State FDA für die Behandlung von verschiedenen malignen Erkrankungen zugelassen. TKI-Behandlung ist, zwar sehr effektiv bei der Bekämpfung der Krankheitsbildes ist es nicht heilende. Außerdem besteht eine kleine Population von Krebszellen während der Behandlung: die MRD3,4,5. Selbst Patienten, die eine kompletten Remission zeigte bleiben MRD, die schließlich Ergebnisse in Rückfall, wenn nicht ständig unterdrückt. Daher ist die Beseitigung der MRD-Zellen benötigt, um eine dauerhafte oder heilende Reaktion zu erreichen. CML ist eine wertvolle Paradigma für das Konzept der Präzisionsmedizin, Mechanismen der Onkogenese, rationale Ziel gerichtete Therapie, Krankheitsverlauf und Resistenzen zu definieren. Aber auch heute noch die TKI-induzierte Zelltod bei Krebszellen zu fahren ist nicht vollständig geklärt, noch warum MRD Zellen (bestehend aus leukämischen Stammzellen [LSCs]) sind intrinsisch resistent gegen TKIs4,6. Dennoch ist das Phänomen der “Onkogen Abhängigkeit von” mutierten Kinase Oncoprotein TKI Wirksamkeit beteiligt wo die akuten Hemmung der gezielten Onkogen von TKIs einen onkogenen Schock verursacht, der zu einer massiven Proapoptotic Antwort oder Ruhe in Zelle führt Kontext-abhängigen Weise6,7,8,9. Es fehlen jedoch die mechanistische Onkogen Abhängigkeit zu untermauern. Jüngste Studien haben verwickelt, dass Onkogen Abhängigkeit hebt Wachstumsfaktor Signal- und folglich Resistenz zu TKI-Therapie10,11,12 verleiht. Daher durchgeführt, um einen Einblick in den Mechanismus der Onkogen Abhängigkeit, wir Vollständiggenom Expression profiling von BCR-ABL1 süchtig und nonaddicted Zellen (gewachsen mit Wachstumsfaktoren), die ergab, dass c-Fos und Dusp1 wichtige Mediatoren der sind Onkogen sucht13. Die genetische Löschung von c-Fos und Dusp1 ist synthetischen tödlich für BCR-ABL1 mit dem Ausdruck Zellen und die Mäuse im Experiment nicht Leukämie entwickeln. Darüber hinaus geheilt die Hemmung der c-Fos und DUSP1 von niedermolekularer Hemmer BCR-ABL1-induzierte CML bei Mäusen. Die Ergebnisse zeigen, dass Ausdruck Niveaus von c-Fos und Dusp1 in Krebszellen, die Apoptotic Schwellenwert definieren, so dass niedrigere Medikament Empfindlichkeit verleihen, während höhere Resistenz gegen Therapie13führen.
Um die Fahrt der Onkogen Abhängigkeit Gene zu identifizieren, haben wir mehrere Vollständiggenom Expressions-profiling Experimente im Beisein von Wachstumsfaktor und einem TKI (Imatinib) mit Maus und CML Patienten gewonnenen Zellen (K562) durchgeführt. Diese Daten wurden analysiert, parallel mit CML Patienten Datensätze CD34 gewonnenen+ Blutstammzellen vor und nach der Behandlung mit Imatinib. Diese Analyse ergab drei Gene (ein Transkriptionsfaktor [c-Fos], duale Spezifität Phosphatase 1 [Dusp1], und ein RNA-bindende Protein [Zfp36]) sind häufig in TKI-resistenten Zellen hochreguliert. Um die Bedeutung dieser Gene in Übertragung Resistenzen zu validieren, werden Schritt für Schritt in Vitro und in Vivo -Analyse durchgeführt. Der Ausdruck Niveaus dieser Gene wurden durch Echtzeit-qPCR (RT-qPCR) und westliche Beflecken in resistenten Zellen bestätigt. Weitere, cDNA-Überexpression und Zuschlag von ShRNA Haarnadeln von c-Fos, Dusp1, und Zfp36 ergab, dass erhöhte c-Fos und Dusp1 Ausdrücke sind ausreichende und notwendige zu TKI-Resistenz verleihen. Daher führten wir eine in-vivo Validierung mithilfe von Mausmodellen mit c-Fos und Dusp1 nur. Für die genetische Validierung von c-Fos und Dusp1 wir ROSACreERT-induzierbaren c-Fosfl/fl Mäuse (conditional Knockout)14 geschaffen und kreuzten sie mit Dusp1– / – (gerade Knockout)15 zu ROSACreERT2-c-Fosfl/fl Dusp1– / – Doppel-transgener Mäuse. Knochenmark stammenden c-Kit+ Zellen (von c-Fosfl/fl-, Dusp1– / –– und c-Fosfl/flDusp1– / –) auszudrücken BCR-ABL1 analysierten in Vitro in einer Kolonie-bildende Einheit (KBE) Assay und in waren Vivo durch Knochenmark-Transplantation bei letal bestrahlten Mäusen, die Anforderung von c-Fos und Dusp1 allein oder zu zweit in Leukämie Entwicklung zu testen. Ebenso die chemische Hemmungen von c-Fos von DFC (Difluorinated Curcumin)16 und Dusp1 von BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 getestet wurden in vitro und in vivo mit BCR-ABL1-mit dem Ausdruck, Knochen Knochenmark stammenden c-Kit+ Zellen von der Wildtyp (WT) Maus. Um die Anforderung des c-Fos und Dusp1 in leukämischen Stammzellen zu bestätigen, haben wir eine CML-Maus-Modell wo BCR-ABL1 speziell in seiner Stammzellen durch Doxycyclin (Tet-Transaktivator drückt unter murinen Stammzellen Leukämie (SCL) Gen 3′ Enhancer induziert wurde verwendet Verordnung)18,19. Wir verwendeten Knochenmark Lin–Sca+c-Kit+ (LSK) Zellen aus diesen Mäusen in einer in-vivo-Transplantation-Assay. Darüber hinaus wir Phopsho-p38 Ebenen und den Ausdruck von IL-6 als Pharmako-Dynamik Biomarker für Dusp1 und c-Fos Hemmung bzw. geschaffen, in Vivo. Zu guter Letzt, die Studie zur Relevanz für den Menschen, Patienten abgeleitet CD34 auszudehnen+ Zellen (entspricht der c-Kit+ -Zellen von Mäusen) wurden langfristige unterzogen in-vitro-Kultur-Einleitung Zelle Assays (LTCIC) und eine in-vivo humanisierten Mausmodell der CML20,21. Die immungeschwächte Mäuse wurden mit CML CD34 + Zellen, gefolgt von medikamentöse Behandlung und Analyse der menschlichen leukämischen Zellen überleben transplantiert.
In diesem Projekt entwickeln wir Methoden für Zielkennzeichnung und Validierungen mit genetischen und chemischen Werkzeugen mit verschiedenen präklinischen Modellen. Diese Methoden können erfolgreich angewendet werden, um andere Ziele entwickeln chemische Modalitäten für die therapeutische Entwicklung zu überprüfen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Für den Großteil der Krebszellen ist die therapeutische Reaktion zu TKI durch eine Blockade der Tyrosin-Kinase-Oncoprotein Signale vermittelt, bei denen der Tumor süchtig ist. Jedoch ist relativ wenig bekannt über wie eine Minderheit von Krebszellen, die einen Beitrag zur MRD escape das Onkogen Abhängigkeit und Therapie4. Neuere Studien gezeigt, dass Wachstumsfaktor Signalisierung Resistenzen in Leukämie und solide Orgel Tumoren vermittelt. Dies deutet darauf hin, dass verschiedene molekular…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren sind dankbar für G. Q. Daley für die Bereitstellung der BaF3 und WEHI-Zellen und T. Reya für MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP konstruiert. Die Autoren sind dankbar, M. Carroll für die Bereitstellung der Patientenproben aus der CML-Explosion-Krise. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse zu M.A von NCI (1RO1CA155091), die Leukämie Research Foundation und V-Stiftung und von der NHLBI (R21HL114074-01).
Materials
| Biological Materials | |||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | Takara | T100B | |
| MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) | Stem Cell | 3434 | |
| MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) | Stem Cell | 4434 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H6278 | |
| Recombinant Murine SCF | Prospec | CYT-275 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Prospec | CYT-340 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
| BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
| Imatinib | LC Laboratory | I-5508 | |
| Curcumin | Sigma | 458-37-7 | |
| NDGA | Sigma | 500-38-9 | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5mg/ml stock in water |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma | S9390 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) | Simga | 1083 | |
| PBS | Corning | 21040CV | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | CO-RO | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5762 | |
| Nitrocullulose Membrane | Bio-Rad | 1620115 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) | Thermo Scientific | 34075 | |
| CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
| CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
| CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
| CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
| CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
| hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
| Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
| Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
| Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
| Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
| Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | 558612 | |
| CD117 APC | BD | 553356 | |
| BD Pharm Lyse | BD | 555899 | |
| BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) | BD | 554714 | |
| BD Perm/Wash (permeabilization and wash solution for phospho flow) | BD | 554723 | |
| phospho p38 | Cell Signaling Technologies | 4511S | |
| total p38 | Cell Signaling Technologies | 9212 | |
| Mouse IgG control | BD | 554121 | |
| Alexa Flour 488 conjugated | Invitrogen | A-11034 | |
| Calcium Chloride | Invitrogen | K278001 | |
| 2X HBS | Invitrogen | K278002 | |
| EDTA | Ambion | AM9261 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Blood Capillary Tubes | Fisher | 22-260-950 | |
| Blood Collection Tube | Giene Bio-One | 450480 | |
| Newborn Calf Serum | Atlanta biological | S11295 | |
| Erythropoiein | Amgen | 5513-267-10 | |
| human SCF | Prospec | CYT-255 | |
| Human IL-3 | Prospec | CYT-210 | |
| G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
| GM-CSF | Prospec | CYT-221 | |
| MyeloCult (media for LTCIC assay) | Stem Cell Technologies | 5100 | |
| Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate | Stem Cell Technologies | 7904 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock in water |
| Bacto agar (agar) | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Doxycycline chow | TestDiet.com | 52662 | modified RMH1500, Autoclavable 5LK8 with 0.0625% Doxycycline |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Iodonitrotetrazolium chloride | Sigma | I10406 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) | Promega | M1722 | |
| miRNeasy Mini Kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 217084 | |
| DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
| Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) | Bio-Rad | 1725270 | |
| CD117 MicroBead Kit | Miltenyi | 130-091-224 | |
| Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay | Stemp Cell Technologies | ||
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | ||
| C-1000 Thermal cycler | Bio-RAD | ||
| Mastercycler Real Plex 2 | Eppendorf | ||
| ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) | Bio-RAD | 17001401 | |
| Hemavet ( boold counter) | Drew-Scientific | ||
| LSR II ( FACS analyzer) | BD | ||
| Fortessa I ( FACS analyzer) | BD | ||
| FACSAriaII ( FACS Sorter) | BD | ||
| Magnet Stand | Miltenyi | ||
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Model 68A | source Cs 137 |
| Mice | |||
| ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
| Scl-tTA | Dr. Claudia Huettner’s lab | ||
| BoyJ | mouse core facility at CCHMC | ||
| C57Bl/6 | Jackson Laboratory | ||
| NSGS | mouse core facility at CCHMC | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- | Made in house | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | Made in house | ||
| Cells | |||
| BaF3 | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| WEHI | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| CML-CD34+ and Normal CD34+ cells | University Hospital, University of Cincinnati |
Referencias
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- . SuperScript™ III First-Strand Synthesis System Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051 (2018)
- . Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay Available from: https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html (2018)
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