Методы для оценки роли c-Fos и Dusp1 в зависимости от онкогена
Summary
Здесь мы описываем протоколы для проверки генетические и химические c-Fos и Dusp1 как цель наркотиков в лейкоз, с использованием модели в vitro и in vivo генетических и гуманизированные мыши. Этот метод может применяться к любой цели генетической проверки и терапевтические развития.
Abstract
Демонстрация ингибитора киназы тирозина (TKIs) в лечении хронический миелолейкоз (CML) ознаменовало новую эру в терапии рака. Однако имеется небольшая популяция клеток не реагировать тки лечения, что приводит к минимальной остаточной болезни (моб); даже наиболее мощным TKIs не в состоянии искоренить эти клетки. Эти клетки MRD служат водохранилище развивается устойчивость к терапии. Не известно, почему тки лечения неэффективны против MRD клетки. Фактор роста сигнализации подразумевается в поддержке выживания MRD клеток во время лечения тки, но хватает механистического понимания. Недавние исследования показали, что повышенные c-Fos и выражение Dusp1 результате конвергентной онкогенных и фактор роста сигнализации в клетках MRD посредником тки сопротивления. Генетические и химическое ингибирование c-Fos и Dusp1 оказывает CML изысканно чувствительна к TKIs и лечит ХМЛ в обеих моделях генетических и гуманизированные мыши. Мы определили эти целевых генов, используя несколько microarrays тки чувствительных и – устойчивостью клеток. Здесь мы предлагаем методы для целевой проверки с использованием моделей мышей в vitro и in vivo. Эти методы могут легко применяться к любой цели генетической проверки и терапевтические развития.
Introduction
Учредительный тирозин киназы активность онкогена сплавливания BCR-ABL1 вызывает CML, который обеспечивает логическое обоснование для целевым активность протеинкиназы ингибиторов малые молекулы. Успех TKIs в лечении больных ХМЛ революцию в концепции таргетная терапия1,2. Впоследствии, анти киназы терапии как точность медицины был разработан для нескольких других злокачественных опухолей, включая солидных опухолей. Пока более тридцати ингибитора киназы были одобрены Объединенной государства FDA для лечения различных злокачественных опухолей. Хотя тки лечение очень эффективен в подавлении заболевание, это не лечебной. Кроме того, имеется небольшая популяция клеток рака сохраняется во время лечения: MRD3,4,5. Даже пациенты, которые показали полной ремиссии остались с моб, который в конечном итоге результаты в рецидив, если не постоянно подавляются. Таким образом ликвидация MRD клеток необходима для достижения прочного или лечебных ответ. CML представляет собой ценный парадигмы для определения понятие точности медицины, механизмы онкогенеза, рациональные направлена целевой терапии, прогрессирования заболевания и лекарственной устойчивости. Тем не менее даже сегодня, механизм вождения тки индуцированной клеточной гибели раковых клеток не поняты, ни почему MRD клетки (состоящий из лейкозных стволовых клеток [LSCs]) внутренне устойчивы к TKIs4,6. Тем не менее феномен «онкогена зависимости «мутант киназы онкопротеин причастны тки эффективность, где острые ингибирование целевых онкогена, TKIs вызывает онкогенных шок, который приводит к массовым проапоптотических ответ или покоя в ячейке контекстно зависимые образом6,,78,9. Однако хватает механистический основу онкогена зависимость. Недавние исследования замешаны что фактор роста сигнализации аннулирует онкогена зависимость и следовательно наделяет сопротивление ТКИ терапии10,,1112. Поэтому чтобы разобраться в механизме онкогена зависимости, мы провели всего генома выражение профилирования от BCR-ABL1 зависимым и nonaddicted клетки (выращенных с факторами роста), которые показали, что c-Fos и Dusp1 являются критическим медиаторов онкогена наркомании13. Генетических исключение c-Fos и Dusp1 является синтетический смертельны для выражения BCR-ABL1 клетки и мышей, используемые в эксперименте не развиваться лейкемия. Кроме того ингибирование c-Fos и DUSP1 в малых молекул ингибиторов вылечить BCR-ABL1-индуцированной CML мышей. Результаты показывают, что уровни выражения c-Fos и Dusp1 определить порог apoptotic в раковых клетках, таким образом, что более низкие уровни возлагают лекарственной чувствительности при более высоких уровнях вызывают резистентность к терапии13.
Чтобы определить гены, вождения онкогена зависимость, мы провели несколько выражение всего генома, профилирование эксперименты в присутствии фактор роста и тки (imatinib) с помощью мыши – и CML пациента производные клетки (K562). Эти данные были проанализированы параллельно с CML пациента наборы данных, полученные из CD34+ гемопоэтических стволовых клеток до и после лечения иматиниба. Этот анализ выявил три генов (транскрипционный фактор [c ПКС], двойной специфика фосфатазы 1 [Dusp1] и RNA-связывая протеинов [Zfp36]), часто upregulated в тки устойчивостью клеток. Чтобы проверить значение этих генов в присвоении лекарственной устойчивости, мы осуществили поэтапный анализ in vitro и in vivo . Уровни выражения этих генов были подтверждены ПЦР в реальном времени (RT-ПЦР) и Западный blotting лекарственно-клетках. Кроме того, гиперэкспрессия cDNA и сногсшибательно, индуцируемый заколки c-ПКС, Dusp1, и Zfp36 показали, что повышенные c-Fos и Dusp1 выражения, достаточно и необходимо придать тки сопротивления. Таким образом мы провели в естественных условиях проверки, с помощью мыши модели только с c-Fos и Dusp1. Для генетической проверки c-Fos и Dusp1 мы создали ROSACreERT индуцибильный c-Fosfl/fl мышей (условное нокаут)14 и скрещивали их с Dusp1– / – (прямая нокаут)15 сделать ROSACreERT2-c-Fosfl/fl Dusp1– / – двойной трансгенных мышей. Клетки костного мозга, полученных c комплект+ (от c-Fosfl/fl-, Dusp1– / –– и c-Fosfl/flDusp1– / –) выразил BCR-ABL1 были проанализированы в пробирке в колонии формируя assay блок (CFU) и в VIVO трансплантации костного мозга в смертельно облученного мышей, проверить требования c-Fos и Dusp1 отдельно или вместе в развития лейкоза. Аналогичным образом, химическая запреты c-Fos DFC (difluorinated куркумин)16 и Dusp1, BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 были протестированы в vitro и in vivo, используя BCR-ABL1-выражая, кость клетки костного мозга, полученных c комплект+ от дикого типа мыши (WT). Чтобы подтвердить требование c-Fos и Dusp1 в лейкозных стволовых клеток, мы использовали модель мыши CML, где BCR-ABL1 был специально индуцированных в его стволовых клеток доксициклин (тет transactivator выражает под мышиных стволовых клеток лейкемии (SCL) ген 3′ усилитель 18,регулирование)19. Мы использовали костного Линь–c комплект Sca++ (ЛСК) клетки от этих мышей в assay в естественных условиях пересадки. Кроме того, мы создали phopsho-p38 уровней и выражение ИЛ-6 как Фармако динамические биомаркеров для Dusp1 и c-Fos ингибирование, соответственно, в естественных условиях. Наконец, расширить сферу охвата исследования человека актуальности, пациент производные CD34+ клеток (эквивалент в c комплект+ клетки от мышей) были подвергается долгосрочный в пробирке инициирование культуры клеток анализов (LTCIC) и в естественных условиях гуманизированные мыши модель CML20,21. Иммунодефицитных мышей были пересажены с CML CD34 + клеток, следуют медикаментозное лечение и анализ выживаемости лейкозных клеток человека.
В этом проекте мы разрабатываем методы для идентификации цели и проверки с помощью генетических и химических средств, с использованием различных доклинических моделей. Эти методы могут успешно применяться для проверки других целей разработки химических методов терапевтического развития.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для подавляющего большинства раковых клеток терапевтический ответ тки опосредовано блокаду тирозин киназы онкопротеин сигналов, к которым пристрастилась опухоли. Однако относительно мало известно о как меньшинство раковых клеток, способствуя MRD избежать онкогена зависимость и тера?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарны G. Q. Дейли для обеспечения BaF3 и WEHI клеток и т. Рея для MSCV-BCR-ABL-Ires-рекламы ЯФП конструкций. Авторы благодарны м. Кэрролл для предоставления пациентов образцов из кризиса CML взрыва. Это исследование было поддержано грантов для м.а. от NCI (1RO1CA155091), лейкемии исследовательский фонд и Фонд V и от NHLBI (R21HL114074-01).
Materials
| Biological Materials | |||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | Takara | T100B | |
| MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) | Stem Cell | 3434 | |
| MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) | Stem Cell | 4434 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H6278 | |
| Recombinant Murine SCF | Prospec | CYT-275 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Prospec | CYT-340 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
| BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
| Imatinib | LC Laboratory | I-5508 | |
| Curcumin | Sigma | 458-37-7 | |
| NDGA | Sigma | 500-38-9 | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5mg/ml stock in water |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma | S9390 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) | Simga | 1083 | |
| PBS | Corning | 21040CV | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | CO-RO | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5762 | |
| Nitrocullulose Membrane | Bio-Rad | 1620115 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) | Thermo Scientific | 34075 | |
| CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
| CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
| CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
| CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
| CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
| hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
| Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
| Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
| Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
| Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
| Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | 558612 | |
| CD117 APC | BD | 553356 | |
| BD Pharm Lyse | BD | 555899 | |
| BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) | BD | 554714 | |
| BD Perm/Wash (permeabilization and wash solution for phospho flow) | BD | 554723 | |
| phospho p38 | Cell Signaling Technologies | 4511S | |
| total p38 | Cell Signaling Technologies | 9212 | |
| Mouse IgG control | BD | 554121 | |
| Alexa Flour 488 conjugated | Invitrogen | A-11034 | |
| Calcium Chloride | Invitrogen | K278001 | |
| 2X HBS | Invitrogen | K278002 | |
| EDTA | Ambion | AM9261 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Blood Capillary Tubes | Fisher | 22-260-950 | |
| Blood Collection Tube | Giene Bio-One | 450480 | |
| Newborn Calf Serum | Atlanta biological | S11295 | |
| Erythropoiein | Amgen | 5513-267-10 | |
| human SCF | Prospec | CYT-255 | |
| Human IL-3 | Prospec | CYT-210 | |
| G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
| GM-CSF | Prospec | CYT-221 | |
| MyeloCult (media for LTCIC assay) | Stem Cell Technologies | 5100 | |
| Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate | Stem Cell Technologies | 7904 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock in water |
| Bacto agar (agar) | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Doxycycline chow | TestDiet.com | 52662 | modified RMH1500, Autoclavable 5LK8 with 0.0625% Doxycycline |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Iodonitrotetrazolium chloride | Sigma | I10406 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) | Promega | M1722 | |
| miRNeasy Mini Kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 217084 | |
| DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
| Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) | Bio-Rad | 1725270 | |
| CD117 MicroBead Kit | Miltenyi | 130-091-224 | |
| Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay | Stemp Cell Technologies | ||
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | ||
| C-1000 Thermal cycler | Bio-RAD | ||
| Mastercycler Real Plex 2 | Eppendorf | ||
| ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) | Bio-RAD | 17001401 | |
| Hemavet ( boold counter) | Drew-Scientific | ||
| LSR II ( FACS analyzer) | BD | ||
| Fortessa I ( FACS analyzer) | BD | ||
| FACSAriaII ( FACS Sorter) | BD | ||
| Magnet Stand | Miltenyi | ||
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Model 68A | source Cs 137 |
| Mice | |||
| ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
| Scl-tTA | Dr. Claudia Huettner’s lab | ||
| BoyJ | mouse core facility at CCHMC | ||
| C57Bl/6 | Jackson Laboratory | ||
| NSGS | mouse core facility at CCHMC | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- | Made in house | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | Made in house | ||
| Cells | |||
| BaF3 | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| WEHI | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| CML-CD34+ and Normal CD34+ cells | University Hospital, University of Cincinnati |
Referencias
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247, 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).
- Mahon, F. X., et al. Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial. Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).
- O’Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia. Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).
- Rousselot, P., et al. Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years. Blood. 109, 58-60 (2007).
- Krause, D. S., Van Etten, R. A. Tyrosine kinases as targets for cancer therapy. The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and “oncogenic shock”. Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy. Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).
- Weinstein, I. B. Cancer. Addiction to oncogenes–the Achilles heal of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
- Corbin, A. S., et al. Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).
- Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487, 500-504 (2012).
- Wilson, T. R., et al. Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors. Nature. 487, 505-509 (2012).
- Kesarwani, M., et al. Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia. Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).
- Zhang, J., et al. c-fos regulates neuronal excitability and survival. Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).
- Dorfman, K. Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts. Oncogene. 13, 925-931 (1996).
- Padhye, S., et al. Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice. Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).
- Zhang, B., et al. Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate. Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).
- Koschmieder, S., et al. Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis. Blood. 105, 324-334 (2005).
- Abraham, S. A., et al. Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells. Nature. 534, 341-346 (2016).
- Li, L., et al. Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib. Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).
- . Qiagen-miRNAeasy kit Available from: https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources (2018)
- . DNA-free DNA removal kit Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s (2018)
- . SuperScript™ III First-Strand Synthesis System Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051 (2018)
- . Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay Available from: https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html (2018)
- Abarrategi, A., et al. Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches. Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).
- Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
