Reglamento de medio ambiente de la cromatina es un proceso esencial para expresión génica adecuada. Aquí, describimos un método para controlar la expresión génica a través de la contratación de modificadores de la cromatina maquinaria de manera gene-específica y reversible.
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Artículo de método
Reprimiendo la transcripción genética redirigiendo la maquinaria celular con modificadores químicos de epigenéticas
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Resumen
Resumen
Regulación de la compactación de la cromatina es un proceso importante que regula la expresión génica en eucariotas superiores. Aunque la compactación de la cromatina y regulación de la expresión génica se interrumpen comúnmente en muchas enfermedades, ha faltado un método para estudiar y controlar estos mecanismos de acción específicas de locus endógeno y reversible. Para solucionar este problema, hemos desarrollado y caracterizado novela moléculas bifuncionales Regulación génica. Uno de los componentes de la molécula bifuncional se une a un anclaje de proteínas de ADN que se reclutarán a un locus específico de alelo. El otro componente activa endógena celular maquinaria de modificadores de la cromatina, reclutamiento de estas proteínas a un gen de interés. Estas pequeñas moléculas, llamadas modificadores químicos epigenéticos (CEMs), son capaces de controlar la expresión de genes y el ambiente de la cromatina en forma dosis dependiente y reversible. Aquí detallamos un enfoque CEM y su aplicación para disminuir la expresión génica y la acetilación de histonas cola a un reportero de la proteína fluorescente verde (GFP) situado en el locus Oct4 en células madre embrionarias de ratón (troncales). Caracterizamos el plomo CEM (CEM23) mediante microscopia fluorescente, citometría de flujo e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), seguida de una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Mientras que la potencia de este sistema se demuestra en el locus Oct4 , conceptualmente, la tecnología CEM es modular y puede ser aplicada en otros tipos celulares y en otros lugares geométricos genomic.
Introducción
La cromatina consiste en ADN envuelto alrededor de las proteínas de octámero de histonas que forman la partícula núcleo del nucleosoma. Regulación de la compactación de la cromatina es un mecanismo esencial para adecuada ADN reparación, replicación y expresión1,2,3. Una forma en la que las células controlan el nivel de compactación es a través de la adición o eliminación de varias modificaciones de cola post-traduccionales de la histona. Dos tales modificaciones incluyen acetilación de la lisina (1), que es más comúnmente asociada con la activación del gen, y la metilación de....
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Protocolo
1) cultura de línea de la célula para la producción de Lentivirus
- Crecer, paso bajo (menos de paso 30) células de riñón embrionario humano (HEK) 293T en alta glucosa Dulbecco de modificado Eagle de media base mediano (DMEM) suplementado con 10% suero fetal bovino (FBS), 10 mM HEPES, 1 x aminoácidos no esenciales (AANE), pluma / Estreptococo, 2 mercaptoenthanol en una incubadora de 37 ° C con 5% CO2. Dividir las celdas cada 3-5 d y antes de que se vuelven confluentes de > 95%.
- Paso de las células HEK 293T con 18 x 106 por placa de 15 cm (una placa de 15 cm para cada virus producida).
- Para un formato de 15 cm, aspirar vi....
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Resultados
Recientemente había desarrollado CEMs y demostró que esta tecnología puede aplicarse para regular la expresión de genes y el ambiente de la cromatina en un locus de reportero en una manera dosis dependiente y reversible. En la figura 1, se muestra un modelo del cable de la CEM, CEM23. Maquinaria HDAC es reclutada al lugar geométrico de reportero por el inhibidor HDAC que, en este caso, es el reportero GFP insertado en el locus Oct4 .
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Discusión
Aquí, describimos el sistema recientemente desarrollado de CEM se aplica para regular la expresión de genes y medio ambiente de la cromatina en un gen específico en una manera dose-dependent. Ofrecemos un método preciso para estudiar la dinámica implicada en la regulación de expresión génica a través de la contratación selectiva de proteínas reguladoras específicas cromatina endógena. Esta es una tecnología altamente modular que puede ser aplicada para investigar cómo diferentes proteínas y cromatina-modificadores comple.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a los miembros de los laboratorios de Hathaway y Jin para sus discusiones útiles. Los autores agradecen también Dan Crona y Ian MacDonald para su lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado en parte por Grant R01GM118653 de los institutos nacionales de salud de Estados Unidos (a N.A.H.); y por donaciones R01GM122749, R01CA218600 y R01HD088626 de la Nacional de los Estados Unidos institutos de salud (J.J.). Este trabajo fue apoyado también por un nivel 3 y un estudiante becado por la UNC Eshelman Instituto de innovación (N.A.H y A.M.C, respectivamente). Financiación adicional de un GM007092 de T-32 (a A.M.C) apoyó este trabajo.....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM | Corning | 10-013CV | |
| NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| HEPES (para cultivo de tejidos) | Corning | 25-060-Cl | |
| BME (2-Mercaptoetanol) | Gibco | 21985-023 | |
| FBS | Atlantic Biologicals | S11550 | Lotes individuales probados para |
| tubos | Covaris de calidadThermoScientific | C4008-632R | |
| Tapones Covaris | ThermoScientific | C4008-2A | |
| PEI (polietilenimina) | Polysciences | 23966-1 | |
| Medios de transfección (Opti-mem) | Gibco | 31985070 | |
| Tubos de centrífuga de virus | Beckman Coulter | 344058 | |
| Membrana de filtro de virus | Corning | 431220 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | SC134220 | |
| 0,25 % Tripsina | Gibco | 25200-056 | con EDTA |
| 0,05 % Tripsina | Gibco | 25400-054 | con EDTA |
| Puromicina | InvivoGen | ant-pr | |
| Blasticidina | InvivoGen | ant-bl | |
| SYBR Green Master Mix (colorante de cianina asimétrico) | Roche | 4913914001 | |
| H3K27ac anticuerpo | Abcam | ab4729 | |
| (kit ChIP) ChIP-IT Kit de alta sensibilidad | Motivo activo | 53040 | |
| Sonicator | Covaris | E110 | |
| Ultracentrífuga | Optima | XPN-80 | |
| SW-32 rotor centrífugo | Beckman Coulter | 14U4354 | |
| Cucharas centrífugas SW-32 Ti | Beckman Coulter | 130.2 | |
| LentiX 293 Riñón embrionario humano | Clontech | 632180 | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BSA | Fisher | BP9700 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| Glicerol | Fisher | G33-1 | |
| Tris | Fisher | BP152 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| Triton | MP Biomedicals | 807426 | |
| Glicina | Fisher | BP381-500 | |
| Tampón TE | Fisher | BP2474-1 | |
| HEPES (para ChIP) | Fisher | BP310-100 | |
| Gelatina | Sigma | G1890 | |
| Citómetro de flujo, Attune NxT | Thermo Fisher | A24858 | |
| FKBP-Gal4 plásmido | Addgene | 44245 | |
| psPAX2 plásmido | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G plásmido | Addgene | 12259 | |
| Nanogotas | MegaShear | N/A | |
| DNA Nanodrop | Thermo Fisher | ND1000 | |
| Inhibidores de la proteasa (leupeptina) | Calbiochem/EMD | 108975 | |
| Inhibidores de la proteasa (quimostatina) | Calbiochem/EMD | 230790 | |
| Inhibidores de la proteasa (pepstatina) | Calbiochem/EMD | 516481 | |
| CiA:Oct4 mESC | El amable regalo de G. Crabtree | ||
| Lif-1C-alfa - producción de células Cos | El amable regalo de J. Wysocka |
Referencias
- Alabert, C., Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).
- Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).
- Bannister, A. J., Kouz....
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