Регулирование окружающей среды хроматина является важным процессом для надлежащего ген выражение. Здесь мы описываем метод для контроля экспрессии генов путем набора chromatin изменения механизма ген специфического и обратимым образом.
Регулирование хроматина уплотнения является важным процессом, который регулирует экспрессию генов у высших эукариот. Хотя во многих заболеваний обычно разрушаются хроматина уплотнения и регулирование выражение гена, локус конкретных, эндогенного и реверсивные метод для изучения и контроля этих механизмов действий отсутствует. Для решения этой проблемы, мы разработали и характеризуется романа Джин регулируя бифункциональных молекул. Одним из компонентов бифункциональных молекулы связывается с ДНК белковых якорь так, что он будет набираться для Аллел Специфически Локус. Другой компонент занимается эндогенного chromatin изменения клеточными, рекрутинг эти белки для нокдауна определенного гена. Эти малые молекулы, называется химической эпигеномные модификаторы (CEMs), способны контролировать экспрессии генов и окружающей среды хроматина в зависимости от дозы и обратимым образом. Здесь мы подробно CEM подход и его применение к снижению экспрессии генов и ацетилирование гистона хвост на репортера Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП), расположенный в локусе Oct4 в мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESCs). Мы характеризуют ведущим CEM (CEM23) с помощью флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии и иммунопреципитации chromatin (обломока), а затем количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР). В то время как мощности этой системы проявляется в локусе Oct4 , концептуально, CEM технологии является модульной и может быть применен в других типах клеток и в других геномной локусов.
Хроматин состоит из ДНК, обернутые вокруг гистона octamer белков, которые формируют ядро нуклеосома частиц. Регулирование хроматина уплотнения является важнейшим механизмом для надлежащего ДНК ремонт, репликации и выражение1,2,3. Один из способов, в котором клетки контролировать уровень уплотнения является добавление или удаление различных модификаций хвост столб-поступательные гистонов. Две такие изменения включают ацетилирования (1) Лизин, которая чаще всего ассоциируется с активацией генов, и (2) Лизин метилирования, который может быть связан с активации генов или репрессий, в зависимости от контекста аминокислоты. Добавление ацетилирования и метилирования марок катализировано гистона acetyltransferases (шляпы) и гистона methyltransferases (HMTs), соответственно, в то время как удаление знака осуществляется гистона комплексы (ГДА) и demethylases (HDMs гистона ), соответственно4,5. Хотя существование этих белков было известно на протяжении десятилетий, многие механизмы как chromatin изменения механизма работы должным образом регулировать экспрессию генов еще предстоит определить. С хроматином регуляторные процессы являются dysregulated в многих заболеваний человека, новые идеи механистического может привести к будущим терапевтического применения.
В естественных условиях chromatin assay (ЦРУ) является недавно описан метод, который использует химическое индуктором близости (CIP) для управления chromatin изменения механизма набора конкретных Локус6. Эта технология использовалась для изучения расширяющийся список динамики хроматина, включая изменения гистона белки, ремонтом хроматина и транскрипции факторов6,,78,9. На основе CIP хроматина привязывая экзогенно выраженной белков также продлевался мимо ЦРУ для модуляции немодифицированных генетических локусов использования с деактивированной кластерного регулярно Interspaced короткие палиндром повторяет ТРИФОСФАТЫ связанные белком (dCas9) 10 , 11. в системе ЦРУ, были изменены mESCs выразить репортер гена GFP в Oct4 локусе, сильно выраженный и строго регламентируются области генома mESC. Ранее, эта система применялась для описания дозозависимый и обратимым вербовки экзогенно выраженной гетерохроматин протеин 1 (HP1), фермент, который связывает H3K9me3 и распространяет репрессивных знаки (например, H3K9me3) и ДНК Метилирование6. Чтобы выполнить этот тип стратегии набора персонала, mESCs заражены плазмида, выражающий FK506-связывающий белок (FKBP), связанные с Gal4, который является ДНК белковых привязку, которая связывает массив Gal4-привязки GFP репортер вверх по течению. Клетки также инфицированы FKBP-rapamycin связывающий домен (FRB), подключенных к HP1. Когда mESCs подвергаются воздействию низких наномолярных концентрациях CIP, rapamycin, FRB и FKBP, сводятся воедино в локусе целевого объекта. В течение дней rapamycin лечения экспрессия гена целевой подавляется, что подтверждается флуоресцентной микроскопии и потока цитометрии и ацетилирование гистона уменьшается, чип и бисульфит последовательности. Хотя разработка и проверка этого подхода были значительные успехи в области исследований хроматина и регулирования, один недостаток — необходимые экзогенных выражение chromatin изменения механизма.
Чтобы сделать технологии, основанные на наборе только эндогенных физиологически соответствующих ферментов и сделать более модульной системы, мы разработан и характеризуется Роман бифункциональных молекул, называемых CEMs (рис. 1)12. Одним из компонентов CEMs включает FK506, который похож на rapamycin, связывает плотно и специально для FKBP. Таким образом CEMs по-прежнему будут набраны к Oct4 локус в ЦРУ mESCs. Другой компонент ПОВ является остаток, который связывает эндогенного chromatin изменения механизма. В экспериментальном исследовании мы протестировали пов, содержащие ингибиторы ГДАЦ. Хотя концепция использования ингибитора набирать гда кажется нелогичным, ингибитор, тем не менее возможность набирать HDAC активность гена интереса. Это достигается путем (1) перенаправление HDAC в локусе, выпуская энзим и увеличение плотности ООН препятствует гда в этом районе и (2) поддержание HDAC ингибирование в локусе, но найма репрессивных комплексы, которые связывают к тормозится гда, (3) или комбинация обоих. В предыдущем исследовании, мы показали, что CEMs смогли успешно подавить GFP-репортер в зависимости от дозы и времени, а также в духе, который был быстро обратимых (т.е., в течение 24 часов)12. Мы были характерны способность CEM технологий, представленные здесь для контроля экспрессии генов с помощью микроскопии флуоресцирования, проточной цитометрии и способности для управления средой хроматина, используя чип ПЦР6. Здесь мы описываем метод для использования и характеризующие пов, которые будут способствовать адаптации этой системы для ответа на дополнительные вопросы, относящиеся к биологии хроматина.
Здесь мы описали недавно разработанная система CEM применяются для регулирования экспрессии генов и окружающей среды хроматина в конкретных генов в зависимости от дозы. Мы предоставляем точный метод для изучения динамики участвует в регуляции экспрессии генов путем выборочного набор?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить членов Hathaway и Цзинь лабораторий за их полезные дискуссии. Авторы также поблагодарить Dan Crona и Иэн Макдональд за их критического чтения рукописи. Эта работа частично поддержали R01GM118653 грант от национальных институтов здравоохранения США (до N.A.H.); и на гранты R01GM122749, R01CA218600 и R01HD088626 от США национального институтов здравоохранения (для J.J.). Эта работа была также поддержана уровня 3 и студент грант от КООН Эшелман Институт инноваций (N.A.H и Мехико, соответственно). Дополнительное финансирование из T-32 GM007092 (в Мехико) поддерживает эту работу. Проточная цитометрия, полученные данные на КООН потока цитометрии Core объекте финансируется P30 CA016086 рака центр основной поддержки Грант на КООН Lineberger всеобъемлющем онкологический центр.
DMEM | Corning | 10-013CV | |
NEAA | Gibco | 11140-050 | |
HEPES (for tissue culture) | Corning | 25-060-Cl | |
BME (2-Mercaptoethanol) | Gibco | 21985-023 | |
FBS | Atlantic Biologicals | S11550 | Individual lots tested for quality |
Covaris tubes | ThermoScientific | C4008-632R | |
Covaris caps | ThermoScientific | C4008-2A | |
PEI (polyethylenimine) | Polysciences | 23966-1 | |
Transfection media (Opti-mem) | Gibco | 31985070 | |
Virus centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
Virus filter membrane | Corning | 431220 | |
Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | SC134220 | |
0.25 % Trypsin | Gibco | 25200-056 | with EDTA |
0.05 % Trypsin | Gibco | 25400-054 | with EDTA |
Puromycin | InvivoGen | ant-pr | |
Blasticidin | InvivoGen | ant-bl | |
SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) | Roche | 4913914001 | |
H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit | Active Motif | 53040 | |
Sonicator | Covaris | E110 | |
Ultracentrifuge | Optima | XPN-80 | |
SW-32 centrifuge rotor | Beckman Coulter | 14U4354 | |
SW-32 Ti centrifuge buckets | Beckman Coulter | 130.2 | |
LentiX 293 Human Embryonic Kidney | Clontech | 632180 | |
PBS | Corning | 46-013-CM | |
BSA | Fisher | BP9700 | |
EGTA | Sigma | E3889 | |
EDTA | Fisher | S311-100 | |
NaCl | Fisher | S271-1 | |
Glycerol | Fisher | G33-1 | |
Tris | Fisher | BP152 | |
NP40 | Roche | 11754599001 | |
Triton | MP Biomedicals | 807426 | |
Glycine | Fisher | BP381-500 | |
TE buffer | Fisher | BP2474-1 | |
HEPES (for ChIP) | Fisher | BP310-100 | |
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Flow cytometer, Attune NxT | Thermo Fisher | A24858 | |
FKBP-Gal4 plasmid | Addgene | 44245 | |
psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | |
pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | |
Nanodroplets | MegaShear | N/A | |
DNA Nanodrop | Thermo Fisher | ND1000 | |
Protease Inhibitors (Leupeptin) | Calbiochem/EMD | 108975 | |
Protease Inhibitors (Chymostatin) | Calbiochem/EMD | 230790 | |
Protease Inhibitors (Pepstatin) | Calbiochem/EMD | 516481 | |
CiA:Oct4 mESC | The kind gift of G. Crabtree | ||
Lif-1C-alpha – producing Cos cells | The kind gift of J. Wysocka |