Cell Cycle analyse in de C. elegans Germline met de Thymidine analoge EdU
Summary
Een imaging gebaseerde methode wordt beschreven dat kan worden gebruikt voor het identificeren van de S-fase en analyseren van de dynamiek van de celcyclus in de C. elegans hermafrodiete germline met behulp van de thymidine analoge EdU. Deze methode vereist geen transgenen en is compatibel met immunefluorescentie kleuring.
Abstract
Analyse van de celcyclus in eukaryoten maakt vaak gebruik van chromosoom morfologie, expressie en/of lokalisatie van gene producten die nodig zijn voor de verschillende fasen van de celcyclus, of de opneming van nucleoside-analogen. Tijdens de S-fase, de polymerase van DNA integreren thymidine analogen zoals EdU of BrdU chromosomale DNA, markering van de cellen voor analyse. Voor C. elegans, de nucleoside analoge EdU wordt gevoed aan de wormen tijdens reguliere cultuur en is compatibel met immunefluorescentie technieken. De kiemcellen van C. elegans is een krachtig model-systeem voor de studies van signalering van trajecten, stamcellen, meiose en celcyclus, want het is transparant, genetisch facile en Meiotische profase en cellulaire differentiatie/geslachtscel optreden in een lineaire montage-achtige manier. Deze eigenschappen maken EdU een geweldig hulpmiddel om de studie van dynamische aspecten van mitotically fietsen cellen en germline ontwikkeling. Dit protocol wordt beschreven hoe u met succes EdU bacteriën bereiden, voeden ze met wild-type C. elegans hermafrodieten, de hermafrodiete gonaden ontleden, vlekken voor EdU opneming in DNA, vlek met antilichamen tegen diverse celcyclus detecteren en Developmental markers, beeld van de gonaden en analyseren van de resultaten. Het protocol beschrijft de variaties in de methode en de analyse voor de meting van de S-fase index, M-fase index G2 duur, celcyclus duur, tarief van Meiotische binnenkomst en tarief van Meiotische profase progressie. Deze methode kan worden aangepast om te bestuderen van de celcyclus of cel geschiedenis in andere weefsels, stadia, genetische achtergronden en fysiologische omstandigheden.
Introduction
In dierlijke ontwikkeling, honderden, duizenden, miljoenen, miljarden of zelfs miljarden celdelingen dienen te vormen van het volwassen organisme. De celcyclus, het aantal cellulaire gebeurtenissen samengesteld uit G1 (gap), S (synthese), G2 (gap), en M (mitose) definiëren de reeks van gebeurtenissen die zijn uitgevoerd elke celdeling. De celcyclus is dynamisch en best gewaardeerde in reële tijd, die kan technisch moeilijk. De technieken die in dit protocol gepresenteerd toelaten dat een om de metingen van de fasen en timing van de celcyclus van stilstaande beelden te maken.
Labelen met nucleoside analogen zoals 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) of 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) is de gouden standaard om te identificeren van de S-fase in de studies van de celcyclus dynamiek in de Caenorhabditis elegans (C. elegans) volwassene hermafrodiete germline1,2,3,4,5. Zowel de EdU als BrdU kan worden gebruikt in bijna elke genetische achtergrond, als zij niet op een genetische construct baseren zich. Visualiseren van BrdU vereist agressieve chemische behandeling om het antigeen voor anti-BrdU antilichamen tegen vlekken, die vaak onverenigbaar is met de beoordeling van andere cellulaire markers gevisualiseerd door mede kleuring met extra antilichamen bloot te stellen. Daarentegen visualiseren EdU treedt op door klik chemie milde omstandigheden en is dus compatibel met antilichaam mede kleuring6,7.
De specificiteit van het label is duidelijk, omdat kernen alleen de (5-ethynyl-2′-deoxyuridine)-analogen van thymidine in DNA tijdens de S-fase integreren. Visualisatie vindt plaats in vaste weefsel. De EdU-label is onzichtbaar vanzelf tot een azide-bevattende kleurstof of fluorophore reageert covalent met de alkyn in EdU door koper-gekatalyseerde Klik scheikunde8. EdU labeling bieden onmiddellijk informatie over welke kernen in de S-fase, met behulp van een korte puls van labeling. EdU kan ook dynamische informatie bieden, met behulp van puls-jacht of continu etikettering; bijvoorbeeld, in een puls-chase experiment, het etiket bij elke celdeling wordt verdund of doorgegeven als nondividing cellen vooruitgang door middel van ontwikkeling.
De C. elegans hermafrodiete germline is een krachtig modelsysteem voor de studies van signalering van trajecten, stamcellen, meiose en celcyclus. De volwassen kiemcellen is een gepolariseerde assemblagelijn met stamcellen gevonden op de distale einde gevolgd door ingang en progressie via Meiotische profase, gecoördineerd met de stadia van de geslachtscel meer proximally (Figuur 1). Proximale eind, eicellen rijpen, zijn algemeen en bevrucht en beginnen embryogenese in de baarmoeder9,10,11. De cel-diameter van ~ 20 lange regio in de buurt van de distale tip-cel, waaronder de mitotically fietsen germline stengel, voorlopercellen en Meiotische cellen in de S-fase maar niet op de cellen in Meiotische profase, heet de voorlopercellen zone2,4 , 9 , 12. de celmembranen bieden onvolledig scheiding tussen de kernen in de distale germline, maar de zone voorlopercellen ondergaan mitotische cel grotendeels zelfstandig fietsen. De duur van de mediane mitotische celcyclus germline van voorlopercellen van zone jonge volwassen hermafrodieten is ~6.5 h; G1-fase is kort of afwezig is, en onbeweeglijkheid1,2,13niet wordt nageleefd. Germline stamcel differentiatie vindt plaats via in wezen directe differentiatie en dus mist transit-sturen divisies4. Tijdens de differentiatie in de pachytene fase, ongeveer 4 van de 5 kernen eicellen niet zullen vormen, maar in plaats daarvan ondergaan apoptosis, fungeert als verpleegkundige cellen door het doneren van hun cytoplasmatische inhoud aan de ontwikkelende oöcyt12,14 , 15.
Naast labeling cellen in de S-fase met nucleoside analogen, men kan het identificeren van de cellen in de mitose en meiose met behulp van antilichaam kleuring. Kernen in de mitose zijn immunoreactive aan anti-phospho-Histon H3 (Ser10) antilichaam (genaamd pH3)7,16. Kernen in meiose zijn immunoreactive naar anti-hem-3 antilichaam (een Meiotische chromosoom as eiwit)17. Kernen in de voorlopercellen zone kunnen worden geïdentificeerd door het ontbreken van HIM-3, de aanwezigheid van het nucleoplasmic van REC-818of de aanwezigheid van WAPL-1-19. WAPL-1 intensiteit is het hoogst in de somatische gonaden, hoog in de zone van voorlopercellen, en lage tijdens de vroege Meiotische prophases19. Verschillende metingen van de celcyclus zijn mogelijk met een paar variaties in het protocol: ik) kernen in de S-fase identificeren en meten van de S-fase index; II) identificeren kernen in M-fase en meten van de M-fase-index; III) bepalen of kernen in mitotische of Meiotische S-fase werden; IV) de duur van de maatregel van G2; V) meten de duartion van G2 + M + G1 fasen; VI) maatregel het tarief van Meiotische binnenkomst; VII) schatting van de mate van Meiotische progressie.
Men kan meerdere metingen van de celcyclus van slechts een paar soorten natte-lab experimenten maken. Het onderstaande protocol beschrijft een 30 min pulse labelen door C. elegans volwassen hermafrodieten vervoederen EdU label bacteriën en co labeling cellen van de M-fase door kleuring met anti-pH3 antilichaam en voorlopercellen zone cellen door kleuring met anti-WAPL-1 antilichaam. Alleen de wijzigingen in de duur van de EdU feed (stap 2.5), soort antilichamen (stap 5), en analyses (stap 8.3) zijn vereist voor de extra metingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voorbereiding van EdU-geëtiketteerden bacteriën (stap 1) is van cruciaal belang voor dit protocol, en het eerste punt voor het oplossen van problemen. De jonge volwassen hermafrodieten wild-type etiket zeer betrouwbaar in een 4 h EdU-pulse, waardoor dit een nuttige controle voor elke nieuwe partij van EdU-geëtiketteerden bacteriën. Bovendien zal intact EdU-geëtiketteerden bacteriën die worden ingevoerd door de darm (in oudere dieren of bepaalde farynx/grinder defecte mutanten) label met klik chemie en worden weerge…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij zijn dankbaar aan de E. coli voorraad center voor MG1693; Wormbase; de Caenorhabditis genetica centrum dat wordt gefinancierd door de nationale instituten van gezondheid Office van onderzoek infrastructuur programma’s (P40OD010440) voor stammen; Zach Pincus voor statistisch advies; Aiping Feng voor reagentia; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar en John Brenner voor opleiding, advies, ondersteuning en nuttige discussie; en de Kornfeld en Schedl labs voor feedback over dit manuscript. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health [R01 AG02656106A1 aan KK, R01 GM100756 naar TS] en een National Science Foundation predoctoraal fellowship [DGE-1143954 en DGE-1745038 naar ZK]. De National Institutes of Health noch de National Science Foundation had een rol in het ontwerp van de studie, verzameling, analyse en interpretatie van gegevens, en geen schriftelijk het manuscript.
Materials
| E. coli MG1693 | Coli Genetic Stock Center | 6411 | grows fine in standard unsupplemented LB |
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10337 | |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | Sigma | 900584-50MG | or use EdU provided in kit |
| Glucose | Sigma | D9434-500G | D-(+)-Dextrose |
| Thiamine (Vitamin B1) | Sigma | T4625-5G | Reagent Grade |
| Thymidine | Sigma | T1895-1G | BioReagent |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M1880-1KG | MgSO4, Reagent Grade |
| Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous | Fisher | BP332-500G | Na2HPO4 |
| Potassium Phosphate, monobasic | Sigma | P5379-500G | KH2PO4 |
| Ammonium Chloride | Sigma | A4514-500G | NH4Cl, Reagent Plus |
| Bacteriological Agar | US Biological | C13071058 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C3881-500G | CaCl |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1KG | Used at 25g/L |
| Levamisole | Sigma | L9756-5G | 0.241g/10ml |
| Phosphate buffered saline | Calbiochem Omnipur | 6506 | homemade PBS works just as well |
| Tween-20 | Sigma | P1379-500ML | |
| 16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10ml ampules |
| 100% methanol | Thermo Fisher Scientific | A454-1L | Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | Lot 1671330 |
| rabbit-anti-WAPL-1 | Novus biologicals | 49300002 | Lot G3048-179A02, used at 1:2000 |
| mouse-anti-pH3 clone 3H10 | Millipore | 05-806 | Lot#2680533, used at 1:500 |
| goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | Lot 1256147, used at 1:400 |
| goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Lot 1511347, used at 1:400 |
| Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation |
| nail polish | Wet n Wild | DTC450B | any clear nail polish should work |
| S-medium | various | see wormbook.org for protocol | |
| M9 buffer | various | see wormbook.org for protocol | |
| M9 agar | various | same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar | |
| Nematode Growth Medium | various | see wormbook.org for protocol | |
| dissecting watch glass | Carolina Biological | 42300 | |
| Parafilm laboratory film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | 4 inch wide laboratory film |
| petri dishes | 60 mm diameter | ||
| Long glass Pasteur pipettes | |||
| 1ml centrifuge tubes | MidSci Avant | 2926 | |
| Tips | |||
| Serological pipettes | |||
| 500 mL Erlenmyer flask | |||
| Aluminum foil | |||
| 25G 5/8” needles | BD PrecisionGlide | 305122 | |
| 5ml glass centrifuge tube | Pyrex | ||
| Borosilicate glass tubes 1ml | |||
| glass slides | |||
| no 1 coverslips 22 x 40 mm | no 1.5 may work, also | ||
| 37 °C Shaker incubator | |||
| Tabletop Centrifuge | |||
| Clinical Centrifuge | IEC | 428 | with 6 swinging bucket rotor |
| Mini Centrifuge | |||
| 20 °C incubator | |||
| 4 °C refrigerator | |||
| -20 °C freezer | |||
| Observer Z1 microscope | Zeiss | ||
| Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens | Zeiss | ||
| Ultraview Vox spinning disc confocal system | PerkinElmer | Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy |
Referencias
- Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -. H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), 2223-2234 (2011).
- Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line. Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).
- Seidel, H. S., Kimble, J. Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch. eLife. 4, (2015).
- Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genética. 201 (9), 167-184 (2015).
- Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans. BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. elegans Cell Cycle Analysis. Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).
- ThermoFisher. . Click-iT EdU Imaging Kits. , (2011).
- Pazdernik, N., Schedl, T. . Germ Cell Development in C. elegans. , 1-16 (2013).
- Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Biología del desarrollo. 49 (1), 200-219 (1976).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77 (1), 71-94 (1974).
- Hansen, D., Schedl, T. Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).
- Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line. Biología del desarrollo. 308 (1), 206-221 (2007).
- Agarwal, I., Farnow, C., et al. HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans. Genética. 208 (2), 745-762 (2018).
- Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline. Development. 126 (5), 1011-1022 (1999).
- Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).
- Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Mü Ller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & development. 13 (17), 2258-2270 (1999).
- Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Biología del desarrollo. 268 (2), 342-357 (2004).
- Crawley, O., Barroso, C., et al. Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes. eLife. 5 (2), 1-26 (2016).
- Zhao, H., Halicka, H. D., et al. DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporated into DNA. Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK. in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).
- Vos, K. . De Cell Counter Plugin. , (2015).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rasband, W. . ImageJ. , (2016).
- Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans. Development. 137 (4), 671-680 (2010).
- Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells. Nature communications. 6 (5), 7107 (2015).
- Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance. Cell. 143 (2), 299-312 (2010).
- Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -. C. daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans. Development. , 4230-4241 (2015).
- Cinquin, A., Chiang, M., et al. Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and. Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985 (2016).
- . . Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine). , 1-7 (2010).
- Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue. Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).
