Cell Cycle Analysis in C. Elegans Keimbahn mit Thymidin-Analog-EdU
Summary
Eine Imaging-basierte Methode beschrieben, die kann verwendet werden, um S-Phase zu identifizieren und analysieren Zellzyklus Dynamik in C. Elegans Hermaphrodit Keimbahn mit dem Thymidin analoge EdU. Diese Methode erfordert keine transgene und ist kompatibel mit immunofluorescent Beflecken.
Abstract
Zellzyklus-Analyse in den Eukaryotes nutzt häufig Chromosom Morphologie, Ausdruck und/oder Lokalisierung von Gen-Produkte für die verschiedenen Phasen des Zellzyklus oder die Einbeziehung von Nukleosid-Analoga. S-Phase enthalten DNA-Polymerasen Thymidin-Analoga wie EdU oder BrdU in chromosomaler DNA, markieren die Zellen für die Analyse. Für C. Elegansder Nukleosid analoge EdU an die Würmer verfüttert wird, während der regulären Kultur und ist kompatibel mit immunofluorescent Techniken. Die Keimbahn von C. Elegans ist ein leistungsfähiges Modell-System für das Studium der Signalisierung Bahnen, Stammzellen, Meiose und Zellzyklus, denn es transparent, genetisch facile ist und meiotischen Prophase und zelluläre Differenzierung/Gametogenese in auftreten einem lineare Montage-wie Mode. Diese Eigenschaften machen EdU ein großartiges Werkzeug, um dynamische Aspekte der mitotically Radsport Zellen und Keimbahn Entwicklung zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt, wie Sie erfolgreich vorbereiten EdU Bakterien, füttern zu Wildtyp C. Elegans Hermaphroditen, Zwitter Gonade sezieren, für EdU Gesellschaftsgründung in DNA, Fleck Fleck mit Antikörpern gegen verschiedene Zellzyklus zu erkennen und Entwicklungs-Marker image die Gonade und analysieren Sie die Ergebnisse. Das Protokoll beschreibt die Unterschiede in der Methode und Analyse für die Messung der S-Phase Index, M-Phase Index G2 Dauer, Dauer des Zellzyklus, Rate der meiotischen Eintrag und meiotischen Prophase Fortschreiten. Diese Methode kann angepasst werden, um den Zellzyklus oder Zelle Geschichte in anderen Geweben, Stadien, genetische Hintergründe und physiologischen Bedingungen zu studieren.
Introduction
In der tierischen Entwicklung müssen Hunderte, Tausende, Millionen, Milliarden oder gar Billionen von Zellteilungen erwachsenen Organismus bilden. Zellzyklus, die Menge der zelluläre Ereignisse bestehend aus G1 (Gap), S (Synthese), G2 (Gap), und M (Mitose) definieren die Reihe von Veranstaltungen, die Ausführung jeder Zellteilung. Der Zellzyklus ist dynamisch und in Echtzeit, was technisch schwierig sein kann, am besten geschätzt. In diesem Protokoll vorgestellten Techniken erlauben es, die Messungen der Phasen und Timing des Zellzyklus von Standbildern zu machen.
Etikettierung mit Nukleosid-Analoga z. B. 5-Ethynyl-2′-Deoxyuridine (EdU) oder 5-Bromo-2′-Deoxyuridine (BrdU) ist der Goldstandard, S-Phase in den Studien des Zellzyklus Dynamik in den Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) Erwachsenen zu identifizieren zwittrige Keimbahn1,2,3,4,5. EdU und BrdU kann in nahezu jedem genetischen Hintergrund verwendet werden, da sie nicht auf irgendwelche genetischen Konstrukt angewiesen sind. Visualisierung von BrdU erfordert harte chemische Behandlung aussetzen Antigen für Anti-BrdU Antikörper Färbung, oft mit der Beurteilung der anderen zellulären Marker visualisiert, indem gemeinsam mit zusätzlichen Antikörper Färbung nicht kompatibel ist. Im Gegensatz dazu visualisieren EdU erfolgt durch Click-Chemie unter milden Bedingungen und ist somit kompatibel mit Antikörper Co Färbung6,7.
Die Besonderheit des Labels ist klar, da Kerne nur die Thymidin (5-Ethynyl-2′-Deoxyuridine) Entsprechungen in DNA während der S-Phase zu integrieren. Visualisierung erfolgt im festen Gewebe. Das EdU Etikett unsichtbar selbst bis eine azid-haltigen Farbstoff oder Fluorophor reagiert kovalent mit Alkinen in EdU durch Kupfer-katalysierte Klick-Chemie-8. EdU Kennzeichnung kann sofortige Auskunft auf die Kerne in S-Phase, einen kurzen Impuls sind der Beschriftung verwenden. EdU kann auch dynamische Informationen bereitstellen, mit Puls-Jagd oder fortlaufende Kennzeichnung; zum Beispiel in einem Puls-Chase-Experiment, das Label wird bei jeder Zellteilung verdünnt oder als nondividing Zellen Fortschritt durch Entwicklung weitergegeben.
C. Elegans Hermaphrodite Keimbahn ist ein leistungsfähiges Modell-System für das Studium der Signalisierung Bahnen, Stammzellen, Meiose und Zellzyklus. Die Erwachsenen Keimbahn ist eine polarisierte Montagelinie mit Stammzellen gefunden am distalen Ende gefolgt von ein- und Progression durch meiotische Prophase, koordiniert mit den Phasen der Gametogenese mehr proximal (Abbildung 1). Am proximalen Ende Eizellen Reifen, sind Eisprung befruchtet und beginnen Embryogenese in der Gebärmutter9,10,11. Die Zelle ~ 20 Durchmesser lange Region nahe der distalen Spitze-Zelle, die mitotically Radsport Germline Stem, Vorläuferzellen und meiotischen Zellen der S-Phase aber nicht auf die Zellen in meiotischen Prophase enthält, nennt man den Stammvater Zone2,4 , 9 , 12. die Zellmembranen bieten unvollständige Trennung zwischen den Kernen in den distalen Keimbahn, aber Zone Vorläuferzellen unterziehen mitotische Zelle Radfahren weitgehend selbstständig. Die mediane mitotische Zelle Zyklusdauer der Keimbahn Zone Vorläuferzellen in jungen Erwachsenen Hermaphroditen ist ~6.5 h; G1-Phase ist kurz oder abwesend, und Ruhe ist nicht eingehalten,1,2,13. Keimbahn Stammzell-Differenzierung erfolgt durch im wesentlichen direkten Differenzierung und somit fehlt Transit-Verstärkung Divisionen4. Während der Differenzierung in der Pachytene Phase etwa 4 von 5 Kerne werden keine Eizellen bilden aber stattdessen Apoptose, als Krankenschwester Zellen durch eine Spende den zytoplasmatischen Inhalt in den Entwicklungsländern Eizelle12,14 , 15.
Neben der Kennzeichnung Zellen in der S-Phase mit Nukleosid-Analoga kann man die Zellen in Mitose und Meiose mit Antikörper Färbung identifizieren. Kerne in Mitose sind immunreaktiven zu Anti-Phospho-Histon H3 (Ser10) Antikörper (so genannte pH3)7,16. Kerne in Meiose sind immunreaktiven Anti-ihn-3 Antikörper (ein meiotische Chromosomen Achse Protein)17. Kerne in der Stammvater Zone können durch das Fehlen von HIM-3, das Vorhandensein von nucleoplasmic REC-818oder das Vorhandensein von WAPL-119identifiziert werden. WAPL-1 Intensität ist in der somatischen Gonade, hoch in der Stammvater Zone am höchsten und niedrigen während frühen meiotischen Prophases19. Mehreren Zellzyklus Messung ist möglich mit ein paar Variationen im Protokoll: ich) Kerne in S-Phase zu identifizieren und Messen S-Phase Index; (II) ermitteln Sie Kerne M-Phase und Messen Sie den M-Phase-Index zu; (III) bestimmen Sie, ob Kerne in mitotischen oder meiotische S-Phase wurden; (IV) messen Sie die Dauer der G2; (V) messen Sie die Duartion G2 + M + G1 Phasen; (VI) messen Sie die Geschwindigkeit der meiotischen Eintrag; (VII) die Rate der meiotic Progression zu schätzen.
Man kann mehrere Zellzyklus-Messungen von nur ein paar Arten von nass-Labor Experimente machen. Das Protokoll unten beschreibt eine 30 min Puls Kennzeichnung durch die Fütterung von C. Elegans adulter Hermaphrodites mit EdU Bakterien und Co Kennzeichnung M-Phase Zellen nach Färbung mit Antikörper Anti-pH3 und Vorläuferzellen Zone Zellen durch Färbung mit Anti-WAPL-1 Antikörper beschriftet. Nur Änderungen in der Dauer der EdU feed (Schritt 2.5), Art der Antikörper eingesetzt (Schritt 5) und Analysen (Schritt 8.3) sind für die weiteren Messungen erforderlich.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vorbereitung der EdU-Label Bakterien (Schritt 1) ist für dieses Protokoll und den ersten Punkt für die Problembehandlung von entscheidender Bedeutung. Wildtyp junge Erwachsene Hermaphroditen Label in einer 4 h EdU-Puls, so dass dies ein nützliches Steuerelement für jede neue Charge mit der Bezeichnung der EdU Bakterien sehr zuverlässig. Darüber hinaus werden intakte EdU-Label Bakterien, die den Darm (in älteren Tieren oder bestimmte Rachen/Mahlwerk defekt Mutanten) geben Sie beschriften mit Click Chemie und ersche…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar für die E. Coli Lager Zentrum für MG1693; Wormbase; die Caenorhabditis Genetik Center das von der nationalen Institute der Gesundheit der Forschung Infrastruktur Büroprogramme (P40OD010440) für Stämme gefördert wird; Zach Pincus für statistische Beratung; Aiping Feng für Reagenzien; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar und John Brenner für Schulung, Beratung, Unterstützung und hilfreiche Diskussion; und das Kornfeld und Schedl Labs für Feedback zu dieser Handschrift. Diese Arbeit wurde teilweise durch die National Institutes of Health unterstützt [R01 AG02656106A1, KK, R01 GM100756 TS] und National Science Foundation predoctoral Fellow [DGE-1143954 und DGE-1745038, ZK]. Weder die National Institutes of Health als auch der National Science Foundation hatte keine Rolle bei der Gestaltung der Studie, Erhebung, Analyse und Interpretation der Daten, noch schriftlich das Manuskript.
Materials
| E. coli MG1693 | Coli Genetic Stock Center | 6411 | grows fine in standard unsupplemented LB |
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10337 | |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | Sigma | 900584-50MG | or use EdU provided in kit |
| Glucose | Sigma | D9434-500G | D-(+)-Dextrose |
| Thiamine (Vitamin B1) | Sigma | T4625-5G | Reagent Grade |
| Thymidine | Sigma | T1895-1G | BioReagent |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M1880-1KG | MgSO4, Reagent Grade |
| Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous | Fisher | BP332-500G | Na2HPO4 |
| Potassium Phosphate, monobasic | Sigma | P5379-500G | KH2PO4 |
| Ammonium Chloride | Sigma | A4514-500G | NH4Cl, Reagent Plus |
| Bacteriological Agar | US Biological | C13071058 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C3881-500G | CaCl |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1KG | Used at 25g/L |
| Levamisole | Sigma | L9756-5G | 0.241g/10ml |
| Phosphate buffered saline | Calbiochem Omnipur | 6506 | homemade PBS works just as well |
| Tween-20 | Sigma | P1379-500ML | |
| 16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10ml ampules |
| 100% methanol | Thermo Fisher Scientific | A454-1L | Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | Lot 1671330 |
| rabbit-anti-WAPL-1 | Novus biologicals | 49300002 | Lot G3048-179A02, used at 1:2000 |
| mouse-anti-pH3 clone 3H10 | Millipore | 05-806 | Lot#2680533, used at 1:500 |
| goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | Lot 1256147, used at 1:400 |
| goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Lot 1511347, used at 1:400 |
| Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation |
| nail polish | Wet n Wild | DTC450B | any clear nail polish should work |
| S-medium | various | see wormbook.org for protocol | |
| M9 buffer | various | see wormbook.org for protocol | |
| M9 agar | various | same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar | |
| Nematode Growth Medium | various | see wormbook.org for protocol | |
| dissecting watch glass | Carolina Biological | 42300 | |
| Parafilm laboratory film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | 4 inch wide laboratory film |
| petri dishes | 60 mm diameter | ||
| Long glass Pasteur pipettes | |||
| 1ml centrifuge tubes | MidSci Avant | 2926 | |
| Tips | |||
| Serological pipettes | |||
| 500 mL Erlenmyer flask | |||
| Aluminum foil | |||
| 25G 5/8” needles | BD PrecisionGlide | 305122 | |
| 5ml glass centrifuge tube | Pyrex | ||
| Borosilicate glass tubes 1ml | |||
| glass slides | |||
| no 1 coverslips 22 x 40 mm | no 1.5 may work, also | ||
| 37 °C Shaker incubator | |||
| Tabletop Centrifuge | |||
| Clinical Centrifuge | IEC | 428 | with 6 swinging bucket rotor |
| Mini Centrifuge | |||
| 20 °C incubator | |||
| 4 °C refrigerator | |||
| -20 °C freezer | |||
| Observer Z1 microscope | Zeiss | ||
| Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens | Zeiss | ||
| Ultraview Vox spinning disc confocal system | PerkinElmer | Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy |
Referencias
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