Scheiding van spinazie thylakoïde eiwitcomplexen door elektroforese van het Gel van de Native groen en karakterisering van de Band met Time-Correlated Single Photon Counting

Summary

Hier presenteren we een protocol om te scheiden van ontbindend thylakoïde complexen door Native groen gelelektroforese. Groene gel banden worden vervolgens gekenmerkt door tijd gecorreleerd Single Photon Counting (TCSPC) en basisstappen voor data-analyse worden verstrekt.

Abstract

De licht-reacties van fotosynthese worden uitgevoerd door een reeks van gepigmenteerde eiwitcomplexen in de thylakoïde membranen. De stoichiometrie en de organisatie van deze complexen op zowel lange als korte tijd schalen als gevolg van de processen die aan te passen aan veranderende milieu omstandigheden fotosynthese hoogdynamische is (dat wil zeggen, niet-fotochemische blussen, staat de overgangen, en de op lange termijn antwoord). Historisch, deze processen zijn beschreven spectroscopically in termen van veranderingen in de chlorofyl fluorescentie en spectroscopie blijft een belangrijke methode voor het fotosynthetische controleparameters. Er zijn een beperkt aantal manieren waarin de onderliggende complexe dynamiek van de eiwitten kunnen worden gevisualiseerd. Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode voor het hoge-resolutie scheiding en visualisatie van thylakoïde complexen, inheemse groene gelelektroforese. Deze methode gaat gepaard met tijd-gecorreleerde één foton tellen voor gedetailleerde karakterisering van de chlorofyl fluorescentie-eigenschappen van bands gescheiden op de groene gel.

Introduction

Fotosynthetische organismen moeten voortdurend hun fysiologie aan veranderende milieu omstandigheden hun productiviteit te maximaliseren en met succes concurreren met buren¹aanpassen. Dit geldt met name voor de machine verantwoordelijk voor de licht-reacties van fotosynthese, als omgevingslicht voorwaarden door drie ordes van grootte tussen donker en vol zonlicht fluctueren kunnen. Bovendien, kunnen milieufactoren zoals droogte, koude of hittestress verminderen de beschikbaarheid van kooldioxide voor fixatie van koolstof, die de natuurlijke elektron gootsteen voor de producten van de licht-reacties. Planten moeten, daarom, oogst en gebruik maken van de zonnestraling zo efficiënt mogelijk met behoud van de mogelijkheid om te verdrijven van overtollige licht energie als dit nodig is. Terwijl photooxidative schade nog steeds routinematig onder alle lichtomstandigheden^2,3, onvermogen om te beheren energie van de geabsorbeerde excitatie met succes kan leiden tot de catastrofale celbeschadiging en dood optreedt. Verschillende adaptieve mechanismen bestaan waarmee de fotosynthetische toestellen worden afgesteld zowel aan veranderingen in de heersende milieuomstandigheden en voorbijgaande fluctuaties (dat wil zeggen, over zowel de korte als de lange termijn)⁴. Het gaat hierbij om de lange termijn response (LTR) en niet-fotochemische blussen (NPQ). NPQ is zelf geacht te omvatten ten minste drie andere component fenomenen, waaronder staat overgangen (qT), snel afleidbare energie blussen (qE) en photoinhibition (qI)⁵.

Deze processen werden oorspronkelijk waargenomen en grotendeels in termen van spectroscopische fenomenen gedefinieerd [bijvoorbeeld NPQ verwijst naar een daling in waargenomen chlorofyl fluorescentie (blussen van chlorofyl fluorescentie) thats niet te wijten aan een toename in de snelheid van Fotochemie]⁶. De term “overgangen van de staat” ook naar de waargenomen verwijst verandering in de relatieve hoeveelheid fluorescentie van PSI en PSII⁷. Terwijl de spectroscopische technieken die opsomming van deze verschijnselen mogelijk hebben gemaakt [inzonderheid pulse amplitude gemoduleerd (PAM) Fluorescentiespectroscopie] en blijven een essentieel middel voor het observeren en het ontleden van fotosynthetische processen in vivo, veel van de biochemie is vereist voor het ophelderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan deze spectroscopische waarnemingen. Staat overgangen, bijvoorbeeld, houdt een fosforylatie/defosforylerings-cyclus van de LHCII eiwitten door de STN7 kinase en fosfatase TAP38/PPH1, respectievelijk^8,9,10. Deze cyclus regelt de fysieke distributie van de antenne van de LHCII tussen de twee photosystems door een deel van LHCII trimeren van PSII naar PSI, waardoor het wijzigen van de absorptie dwarsdoorsnede van de photosystems^11,12. De qE component van NPQ zet snel overtollige excitatie energie in warmte door middel van de acties van de Violaxanthine/zeaxanthine epoxidatie/de-epoxidatie cyclus en de publieke omroepen-eiwit. De exacte rol van publieke omroepen in dit proces is nog steeds niet volledig begrepen¹³. De component van de qI van NPQ, photoinhibition, wordt over het algemeen toegeschreven om schade aan de proteïne van de D1 van PSII. Herstel van volledige fotosynthetische bevoegdheid vereist een uitgebreide herstelproces te repareren van beschadigde PSII photocenters. De PSII reparatie cyclus omvat de migratie van PSII complexen uit de granal stapels, ontmanteling van de complexen, vervanging van beschadigde D1 eiwitten, opnieuw samenstellen van de complexen PSII en verkeer van PSII complexen terug naar de granal stapels¹⁴. De precieze aard van de photoinhibition en PSII photodamage blijft een onderwerp van intensieve controle¹⁵.

De moeilijkheid bij het bestuderen van verschijnselen als staat overgangen of PSII reparatie vloeit gedeeltelijk voort uit het feit dat er niet een eenvoudige manier is te visualiseren van de mechanica van complexe biochemische systemen. De klassieke biochemische aanpak voor het begrip van een proces is het eerst scheiden van zijn onderdelen, zodat ze kunnen worden gekarakteriseerd in isolatie. Native gelelektroforese is ontstaan uit de succesvolle pogingen in de jaren 1980 te scheiden en karakteriseren de Fotosysteem complexen van de thylakoïde membranen met meer voorbereidende methoden (namelijk sacharose kleurovergang centrifugeren en chromatografie)¹⁶. Het wasmiddel systemen ontwikkeld om het zachtjes solubilize de inheemse complexen van de membranen thylakoïde werden snel aangepast aan elektroforetische scheidingsmethoden, vooral door Allen en article¹⁷ en en Peter en Thornber¹⁸, leiden aan inheemse groene gelelektroforese. Hoewel vertegenwoordigen slechts één uit een verscheidenheid van technieken in het experimentele arsenaal, inheemse pagina een aantal aantrekkelijke kenmerken die een algemeen werkzame methode hebben gemaakt in het onderzoek van de fotosynthese heeft. Inheemse pagina is relatief snel en eenvoudig, waarbij weinig gespecialiseerde apparatuur, terwijl het verstrekken van hoge resolutie scheiding van een groot aantal thylakoïde complexen gelijktijdig. Dit zorgt ervoor dat inheemse pagina een handig hulpmiddel voor de studie van thylakoïde dynamiek en, in combinatie met standaard pagina in de tweede dimensie, alsmede een verscheidenheid van wasmiddel en buffer systemen, een veelzijdig systeem voor het zoeken en karakterisering van nieuwe thylakoïde complexen.

Dat gezegd zijnde, hebben inheemse groene gels een reputatie als een onbetrouwbare techniek, met name in onervaren handen, omdat het gemakkelijk is voor de productie van slechte resultaten vage, smeary gels met enkele bands uit. Dit probleem werd opgelost, gedeeltelijk, met de introductie van blauw-native pagina¹⁹. Het gebruik van coommassie kleurstof in de BN buffersysteem maakt eiwit scheiding robuuster. Daarom kan BN-pagina is vaak een gemakkelijker en betrouwbaarder techniek voor een relatieve beginner instellen en hoge resolutie scheidingen van thylakoïde complexen. Om deze redenen geworden BN-pagina de methode van keuze voor het meeste werk voor dit veld. Terwijl BN-pagina over het algemeen langzamer is uitgevoerd dan groene gelelektroforese, het belangrijkste nadeel is dat de coommassie kleurstof kleuring interfereert met de identificatie van zwakke chlorofyl-bevattende bands, terwijl ook downstream spectroscopische karakterisering problematisch.

De biochemische informatie verstrekt door inheemse gels en 2D SDS-pagina kan aanzienlijk worden versterkt in combinatie met gegevens van spectroscopische technieken. Ongeacht het systeem, een centraal probleem met het gebruik van inheemse gels te identificeren complexen is dat er altijd de identificatie kan worden aangevochten (dat wil zeggen, de eiwitten in een band gevonden kan altijd vertegenwoordigen comigrating complexen of onderdelen, eerder dan een enkel fysiologisch authentiek complex). Spectroscopische karakterisering biofysische informatie over de pigmenten in groene gel bands en kan worden gebruikt om te bepalen welke soorten complexen zijn ze waarschijnlijk bevatten. Chlorofyl fluorescentie is vooral nuttig in dit verband als gevolg van de vaak sterk verschillende spectra en de levensduur van de fluorescentie die karakteristiek voor verschillende fotosynthetische pigment-eiwitcomplexen zijn. Terwijl eenvoudige steady-state 77K fluorescentie spectra historisch nuttig zijn bij de bevestiging van de identiteit van de inheemse gel complexen, bieden moderne tijd-gecorreleerde één foton tellen (TCSPC) veel meer informatie. TCSPC kunnen niet alleen de karakterisatie van complexen op basis van de levensduur van de fluorescentie, maar maakt ook mogelijk de gedetailleerde beschrijving van de energie-overdracht tussen spectrale componenten binnen een complex. Dit soort karakterisering wordt steeds noodzakelijker als het gebruik van verschillende inheemse gel systemen spreads en nieuwe putatief complexen worden ontdekt, waardoor de identificatie van eiwitcomplexen beter worden geverifieerd en het verstrekken van nieuwe biofysische informatie over de werking van deze complexen.

In dit document bieden we een methode waarmee degenen die weinig of geen ervaring met inheemse gelelektroforese om de resolutie van de hoge kwaliteit van inheemse thylakoïde complexen met het oog op het onderzoek naar de mechanica van de licht-reacties van fotosynthese. Deze basistechniek kan vervolgens worden opgedreven naar eigen goeddunken van de experimentator resultaten verbeteren of uitbreiden van toepasselijkheid op andere soorten. Vervolgens beschrijven we het proces voor het onderwerpen van inheemse groene gel bands aan het TCSPC, evenals enkele stappen voor fundamentele analyse en betere presentatie van de gegevens verstrekt door de techniek. De koppeling van de inheemse gelelektroforese met TCSPC analyse breidt het nut van deze gel-systemen door middel van verificatie en biofysische karakterisering van eiwitcomplexen binnen de bands. Het systeem van de groene gel hier beschreven is gebaseerd op die ontwikkeld door Allen en article¹⁷ met enkele wijzigingen en is hetzelfde als die in Schwarz et al.gebruikt. ²⁰. dit systeem is een van de vele maar heeft specifieke functies die handig voor deze methode zijn. Het is snel genoeg, zodat thylakoïde isolatie, de gelelektroforese van het en TCSPC analyse handige kunnen worden uitgevoerd op één dag wegnemen van mogelijke problemen van monster opslag en afbraak. Wij vinden ook dat deze methode robuust in de handen van onervaren gebruikers, is terwijl nog steeds resultaten die variëren van goede naar superior, afhankelijk van de mate van optimalisatie.

Het is belangrijk om te beseffen dat de gevisualiseerd op een native gel complexen afhankelijk zijn op zowel het wasmiddel en buffer systemen die worden gebruikt, alsook op de biologische eigenschappen van het organisme onderzocht. Verschillende systemen van wasmiddel en buffer scheiden bij voorkeur verschillende soorten complexen, en een bepaalde fotosynthetische organisme zal hebben verschillende complexen van andere organismen, niet alle die aanwezig zijn in een bepaalde omstandigheid zal zijn. Het systeem hier beschreven is bijzonder geschikt voor de studie van PSI megacomplexes, zoals beschreven in Schwarz et al.. ²⁰, maar het valt op de meer destabiliserende kant van het spectrum voor degenen die studeren van PSII megacomplexes. Voor een uitgebreide studie van de verschillende systemen voor wasmiddel en buffer gebruikt in native gelelektroforese van thylakoïde eiwitten, is het aanbevolen om Järvi et al.bekijken. ²¹ en Rantala et al. ²².

Protocol

1. stamoplossingen voorbereiding voor het gieten van inheemse groene Gels Bereiden een 4 x geconcentreerd bufferoplossing voor het oplossen van gel bestaande uit 40% glycerol, glycine van 200 mM en 100 mM Tris gebufferd op een pH van 8,3. Een 4 x geconcentreerd bufferoplossing voorbereiden stapelen gels, bestaande uit 40% glycerol, glycine van 200 mM en 100 mM Tris gebufferd op een pH van 6.3. Bewaar deze buffers bij 4 ° C om te voorkomen dat de groei van de schimmel.Opmerking: De buffe…

Representative Results

Representatieve resultaten voor groene gelelektroforese worden gepresenteerd in Figuur 1. Lane 1 bevat een voorbeeld van ideale resultaten voor groene gelelektroforese van spinazie ze, waarin een maximum aantal heldere, scherpe groene banden zichtbaar zijn. Deze resultaten zijn enigszins atypisch, gedeeltelijk omdat niet alle van de bands gezien in baan 1 normaal aanwezig zijn in een monster zijn. Extra monster opruimen, in de vorm van chloroplast isolatie vo…

Discussion

Een succesvolle thylakoïde solubilisatie en native gel uitvoeren zal resulteren in de resolutie van meerdere afzonderlijke zichtbaar groene banden op de gel zonder aanzienlijke vervorming of het smeren van de bands. Overbelasting de gel, een hoge concentratie van wasmiddel, een onjuiste monster pH, onopgeloste materiaal, runnen van de gel te snel of bij een te hoge temperatuur, en een ten onrechte gegoten gel zijn allemaal factoren die kunnen bijdragen tot slecht opgelost thylakoïde complexen. Terwijl het optimaliseren…

Materials

Glycine	Sigma	G8898
Tris base	Sigma	#648310
SDS	Sigma	L3771
Decyl Maltoside	Sigma	D7658	n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside
Octyl Glucoside	Sigma	O8001
Acrylamide	BioRad	161-0148	37.5/1 C 40% solution
TEMED	BioRad	161-0800
Ammonium Persulfate	BioRad	161-0700
Magnesium Chloride	Sigma	M2670
Potassium Chloride	Sigma	P9333