Combinando la macchiatura istochimica e l'analisi di immagine per quantificare amido nei primordi dell'ovaia del ciliegio dolce durante la dormienza invernale
Summary
Vi presentiamo una metodologia per quantificare il contenuto di amido nei primordi dell’ovaia in ciliegio dolce (Prunus avium L.) durante la dormienza invernale utilizzando un sistema di analisi di immagine combinato con tecniche istochimiche.
Abstract
Cambiamenti in amido in piccole strutture sono associati con gli eventi chiave durante diversi processi di sviluppo della pianta, compresa la fase riproduttiva da impollinazione fecondazione e l’inizio di fruttificazione. Tuttavia, variazioni di amido durante la differenziazione a fiore non sono completamente noti, principalmente a causa della difficoltà di quantificare il contenuto di amido nelle strutture particolarmente piccole dei primordi del fiore. Qui, descriviamo un metodo per la quantificazione dell’amido nei primordi dell’ovaia del ciliegio dolce (Prunus avium L.) utilizzando un sistema di analisi di immagine collegato al microscopio, che permette riguardanti i cambiamenti nel contenuto di amido con le diverse fasi di dormienza dall’autunno alla primavera. Per questo scopo, lo stato di dormienza di boccioli di fiori è determinato valutando la crescita del germoglio di germogli trasferito a condizioni controllate in diversi momenti nel periodo invernale. Per la quantificazione dell’amido nei primordi ovaia, boccioli di fiori sono in sequenza raccolti, corretti, incorporati in paraffina, sezionati e macchiati con I2Kl (ioduro di potassio-iodio). Preparazioni sono osservati al microscopio e analizzati da un analizzatore di immagine che distingue chiaramente amido dallo sfondo. Valori del contenuto di amido si ottengono misurando la densità ottica dell’immagine che corrisponde all’amido macchiato, considerando la somma della densità ottica di ogni pixel come una stima del contenuto di amido del telaio studiato.
Introduction
Piante perenni legnose temperate adattano alle stagioni, modulando la loro crescita e sviluppo. Mentre si sviluppano durante la primavera e l’estate, smettere di crescere durante l’autunno per andare dormente in inverno1. Anche se dormienza permette loro di sopravvivere alle basse temperature invernali, agghiacciante è un prerequisito per un corretto budburst in primavera2. Le importanti implicazioni di dormienza in produzione frutticola temperato e silvicoltura hanno portato a diversi sforzi per determinare e prevedere il periodo di dormienza3. Arboree da frutto, esperimenti empirici trasferimento germogli per imporre condizioni e statistiche stime basate sui dati della fioritura sono attuali approcci per determinare la data della rottura di dormienza, che permette ai ricercatori di stimare il requisiti per ogni cultivar di refrigerazione. Tuttavia, come determinare lo stato di dormienza basato su processi biologici rimane poco chiaro3.
Fioritura di alberi da frutto temperato, come sweet cherry (Prunus avium L.), si verifica una volta all’anno e dura circa due settimane. Tuttavia, i fiori cominciano a differenziare e sviluppare circa 10 mesi prima, durante l’ estate precedente4. Primordia fiore smettere di crescere durante l’autunno per rimanere dormienti all’interno i germogli durante l’inverno. In questo periodo, ogni cultivar deve accumulare un particolare requisito agghiacciante per corretta fioritura4. Nonostante la mancanza di cambiamenti fenologici nei germogli durante l’inverno, primordia fiore è fisiologicamente attivi durante la dormienza, e l’accumulo di temperature di refrigerazione è stata recentemente associata con la dinamica di accumulo di amido o diminuire all’interno delle cellule del primordio dell’ovaia, che offre un nuovo approccio per dormienza determinazione5. Tuttavia, le piccole dimensioni e la posizione del primordio ovaia richiedono una metodologia speciale.
L’amido è il carboidrato di memoria principale in pianta legnosa specie6. Così, le modifiche in amido hanno riguardate l’attività fisiologica dei tessuti fiore, che hanno bisogno di carboidrati per sostenere il loro sviluppo7,8. Diversi eventi chiavi durante il processo riproduttivo sono anche legati alla variazioni nel contenuto di amido in diverse strutture floreali, come ad esempio antera meiosi9, la crescita dei tubi polline attraverso la fecondazione stile o ovulo10. Tecniche istochimiche consentono la rilevazione dell’amido in ogni tessuto particolare dei primordi fiore durante la dormienza. Tuttavia, la difficoltà rimane nel quantificare tale amido per consentire in seguito il modello di accumulazione/diminuire nel tempo o confrontando l’amido contenuto tra tessuti, cultivar o anni. Ciò è dovuto la piccola quantità di tessuto disponibile per le tecniche analitiche11. In alternativa, analisi dell’immagine legata a microscopia12 permette la quantificazione dell’amido molto piccoli campioni di tessuto di pianta13.
Approcci che combina analisi di microscopia e immagine sono stati usati per quantificare il contenuto di diversi componenti nei tessuti vegetali, come ad esempio callosio14, microprovette15, o fecola16, misurando le dimensioni della zona tinta da specifici macchie. Per amido, può essere facilmente individuata usando lo ioduro di potassio-iodio (ho2KI) reazione17. Questo metodo è altamente specifico; Ho2KI si intercala all’interno della struttura laminare di granuli di amido e forma un colore blu o marrone-rossastro scuro, a seconda del contenuto di amilosio dell’ amido18. Le sezioni colorate con I2macchia KI Visualizza adeguato contrasto tra amido e il tessuto di fondo, permettendo una diagnosi inequivocabile di amido e la successiva quantificazione tramite il sistema di analisi immagine19. Sebbene questo colorante non è stechiometrico, l’accumulo di iodio è proporzionale alla lunghezza della molecola dell’amido, che può variare altamente17. Così, la dimensione della zona macchiata espressa come il numero di pixel potrebbe non riflettere accuratamente il contenuto di amido, poiché alte differenze nel contenuto di amido potrebbero essere trovate tra i campi con aree macchiate di dimensioni simili. In alternativa, il contenuto di amido può essere valutato misurando la densità ottica dei granuli colorati su bianche e nero immagini ottenute dal microscopio, come è stato segnalato in diversi tessuti in albicocca8,13 , 19, avocado10,20e ulivi21.
Qui, descriviamo una metodologia che combina la determinazione sperimentale di stato di dormienza con la quantificazione del contenuto di amido nel tessuto del primordio ovaia dall’autunno alla primavera in ciliegio dolce, che offre un nuovo strumento per la comprensione e la previsione di dormienza basata sullo studio dei meccanismi biologici collegati con dormienza.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dormienza in piante legnose perenni presenta chiare implicazioni nella produzione della frutta e della silvicoltura in un clima che cambia, anche se il processo biologico dietro dormienza rimane poco chiaro. Studi di dormienza possono essere affrontati da diversi punti di vista, ma la ricerca alla ricerca di un marcatore biologico per dormienza invernale si è intensificata negli ultimi anni. Tuttavia, la maggior parte dei tentativi di trovare un indicatore inequivocabile risultati quando un germoglio ha rotto la dormien…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano con gratitudine Maria Herrero ed Eliseo Rivas per loro discussione utili e consigli. Questo lavoro è stato supportato dal Ministerio de Economía y Competitividad — Fondo europeo di sviluppo regionale, dell’Unione europea [concessione numero BES-2010-037992 a E. F.]; l’Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria [grant numeri 00-00015-RFP2015, RTA2014-00085-00, RTA2017-00003-00]; e del Gobierno de Aragón — Fondo sociale europeo, Unione europea [Grupo Consolidado A12-17R].
Materials
| Precision scale | Sartorius | CP225D | |
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | MZ-16 | |
| Drying-stove | Memmert | U15 | |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems | EG1140H | |
| Rotatory microtome | Reichert-Jung | 1130/Biocut | |
| Microtome blade | Feather | S35 | Stainless steel |
| Bright field microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| Digital Camera | Leica Microsystems | DC-300 | |
| Image Analysis System | Leica Microsystems | Quantiment Q550 |
Referencias
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