Histochemical boyama ve nişasta yumurtalık Primordia tatlı kiraz kış uyuşukluk sırasında ölçmek için görüntü analizi
Summary
Biz histochemical teknikleri ile kombine bir görüntü analiz sistemi kullanılarak sırasında kış uyuşukluk yumurtalık primordia tatlı kiraz (Prunus avium L.) içinde nişasta içeriğinde ölçmek için bir metodoloji mevcut.
Abstract
Nişasta küçük yapılarda üreme aşamaya döllenme ve meyve başlangıcı tozlaşma üzerinden de dahil olmak üzere çeşitli bitki gelişim süreçleri sırasında önemli olaylar ile ilişkili değişikliklerdir. Ancak, nişasta değişimler çiçek farklılaşma sırasında tamamen, çiçek primordia özellikle küçük yapıların nişasta içeriğinde miktarının esas zorluğu nedeniyle bilinmemektedir. Burada, farklı aşamaları ile nişasta içeriğinde değişiklikler ile ilgili sağlar mikroskop bağlı bir görüntü analiz sistemi kullanılarak yumurtalık primordia tatlı kiraz (Prunus avium L.) nişasta miktar için bir yöntemi açıklamak Bahar sonbahardan uyuşukluk. Bu amaçla, bud büyüme için kontrollü şartlar kış zamanında farklı anlarda transfer sürgünlerin değerlendirerek çiçek tomurcukları uyuşukluk durumu belirlenir. Yumurtalık primordia nişasta miktar için çiçek tomurcukları ardışık olarak toplanan, sabit, parafin balmumu içinde gömülü, kesitli ve ben ile lekeli2Kl (potasyum iyodür-iyot). Ürünleri mikroskop altında gözlenen ve açıkça nişasta kökenli ayıran bir Image analyzer tarafından incelendi. Nişasta içerik değerleri her bir pikselin optik yoğunluk okudu çerçeve nişasta içeriği bir tahmini olarak toplamı dikkate alınarak lekeli nişasta için karşılık gelen görüntü optik yoğunluk ölçerek elde edilir.
Introduction
Ilıman odunsu çok yıllık bitkiler için mevsim onların büyüme ve gelişme oransal uyum. Bahar ve yaz aylarında geliştirirken, Sonbahar Kış1‘ uyuyan gitmek sırasında büyüyen durdurmak. Uyuşukluk düşük kış ısılarda hayatta kalmak izin verecek, ancak, tüyler ürpertici bir bahar2uygun bir budburst için ön koşuldur. Uyuşukluk ılıman meyve üretim ve Ormancılık önemli etkileri çeşitli çabalarını belirlemek ve uyuşukluk dönem3tahmin açmıştır. Meyve ağacı türleri, ampirik deneyler koşulları ve çiçekli verilerine dayalı istatistiksel tahminler zorlama için sürgünler aktarma uyuşukluk, tahmin etmek araştırmacılar sağlayan kırılması tarihini belirlemek için güncel yaklaşımları vardır. her çeşidinde için gereksinimleri tüyler ürpertici. Ancak, biyolojik süreçleri dayalı uyuşukluk durumunu belirlemek nasıl belirsiz3kalır.
Tatlı kiraz (Prunus avium L.), gibi ılıman meyve ağaçlarında çiçeklenme yılda bir kez oluşur ve hakkında bir iki hafta sürer. Ancak, çiçekler ve dönüşüm sırasında önceki yaz4yaklaşık 10 ay önce geliştirmek için başlatın. Çiçek primordia sonbahar kış aylarında tomurcukları içinde hareketsiz kalır sırasında büyüyen durdurmak. Bu dönemde her çeşidinde uygun çiçekli4için belirli bir tüyler ürpertici gereklilik birikir gerekir. Kış aylarında tomurcukları phenological değişiklikler olmamasına rağmen çiçek primordia sırasında uyuşukluk fizyolojik aktif ve sıcaklık soğutma birikimi son zamanlarda nişasta birikimi dinamik ile ilişkili olduğu veya azaltmak Yumurtalık primordium hücrelerde uyuşukluk belirlenmesi5için yeni bir yaklaşım sunuyor. Ancak, küçük boyutu ve yumurtalık primordium konumunu özel bir metodoloji gerektirir.
Nişasta odunsu bitki tür6büyük depolama karbonhidrat var. Böylece, nişasta değişimler için karbonhidrat onların geliştirme7,8desteklemek için gereken çiçek dokuların etkinlik fizyolojik ile ilgili olduğu. Üreme sürecinde farklı önemli olaylar da nişasta içeriği Anter mayoz9, polen tüplerinin ile stil veya ovule fertilizasyon10büyüme gibi farklı çiçek yapılarda değişimler ilgilidir. Histochemical teknikleri nişasta tespiti sırasında uyuşukluk çiçek primordia her belirli doku sağlar. Ancak, zorluk birikimi/azaltma onun desen zamana veya nişasta karşılaştırma takiben dokuların, çeşitlerin veya yıl arasında içerik izin vermek o nişasta miktarının kalır. Bu doku için analitik teknikler11kullanılabilir küçük miktarda kaynaklanmaktadır. Alternatif olarak, görüntü analiz mikroskobu12 ‘ ye bağlı nişasta miktar bitki doku13çok küçük örnekleri sağlar.
Callose14, mikrotüpler15, gibi bitki dokularında farklı bileşeninin içeriğini ölçmek veya özel tarafından boyanmış alanının boyutunu ölçerek16, nişasta için kullanılan mikroskobu ve görüntü analizi birleştirerek yaklaşımlar lekeleri. Nişasta için bu kolayca potasyum iyodür-iyot kullanarak tespit edilebilir (Ben2KI) tepki17. Bu yöntem son derece özeldir; Ben2KI nişasta taneleri Laminer yapısı içinde intercalates ve koyu mavi veya kırmızımsı kahverengi renk, nişasta18Amiloz içeriğine göre oluşturur. Bölümler ile lekeli2KI leke nişasta ve bir kesin nişasta algılama ve sonraki miktar görüntü analiz sistemi19tarafından izin arka plan doku arasında yeterli kontrast göster. Bu boya stokiometrik olmasa da, iyot birikimi son derece17değişebilir nişasta molekül uzunluğu ile doğru orantılıdır. Böylece, nişasta içeriği yüksek farklılıklar benzer boyutta lekeli alanlar içeren alanlar arasında bulunamadı bu yana piksel sayısı olarak ifade lekeli alanının boyutunu nişasta, içeriğini doğru yansıtmayabilir. Alternatif olarak, nişasta içeriği kayısı8,13 farklı dokularda bildirilmiştir gibi–dan mikroskop, elde edilen siyah beyaz görüntülerde lekeli granül optik yoğunluk ölçme tarafından değerlendirilecek , 19, avokado10,20ve zeytin21.
Burada, anlayış ve tahmin için yeni bir araç sunuyor nişasta içeriği yumurtalık primordium doku tatlı kiraz, Bahar sonbahardan miktar uyuşukluk durum deneysel belirlenmesi birleştiren bir metodoloji açıklamak biyolojik mekanizmaları çalışmaya dayanarak uyuşukluk ve uyuşukluk ile bağlantılı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her ne kadar uyuşukluk arkasında biyolojik süreci belirsizliğini uyuşukluk içinde odunsu uzun ömürlü meyve üretiminde açık etkileri ve Ormancılık değişen bir iklimde sunar. Uyuşukluk çalışmaları farklı açılardan yaklaştı ama kış uyuşukluk biyolojik bir marker arıyorum araştırma son yılda şiddetlendi. Ancak, ne zaman bir tomurcuk uyuşukluk kırık vardır gösteren kesin bir gösterge bulmak için birçok girişimleri başarısız3olmuştur. Histochemical teknikle…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar minnetle Maria Herrero ve Eliseo Rivas onların yararlı tartışma ve tavsiye için teşekkürler. Bu eser “gayri resmi” de Economía y Competitividad tarafından desteklenen — Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu, Avrupa Birliği [grant numarası BES-2010-037992 E. f.]; Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria [grant numaraları RFP2015-00015-00, RTA2014-00085-00, RTA2017-00003-00]; ve Gobierno de Aragón — Avrupa Sosyal Fonu, Avrupa Birliği [Grupo Consolidado A12-17R].
Materials
| Precision scale | Sartorius | CP225D | |
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | MZ-16 | |
| Drying-stove | Memmert | U15 | |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems | EG1140H | |
| Rotatory microtome | Reichert-Jung | 1130/Biocut | |
| Microtome blade | Feather | S35 | Stainless steel |
| Bright field microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| Digital Camera | Leica Microsystems | DC-300 | |
| Image Analysis System | Leica Microsystems | Quantiment Q550 |
Referencias
- Kurokura, T., Mimida, N., Battey, N. H., Hytönen, T. The regulation of seasonal flowering in the Rosaceae. Journal of Experimental Botany. 64 (14), 4131-4141 (2013).
- Rohde, A., Bhalerao, R. P. Plant dormancy in the perennial context. Trends in Plant Science. 12 (5), 217-223 (2007).
- Fadón, E., Rodrigo, J. Unveiling winter dormancy through empirical experiments. Environmental and Experimental Botany. 152, 28-36 (2018).
- Fadón, E., Rodrigo, J., Herrero, M. Is there a specific stage to rest? Morphological changes in flower primordia in relation to endodormancy in sweet cherry (Prunus avium L.). Trees – Structure and Function. , (2018).
- Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. Dormant flower buds actively accumulate starch over winter in sweet cherry. Frontiers in Plant Science. 9 (171), (2018).
- Loescher, W. H., Mccamant, T., Keller, J. D. Carbohydrate reserves, translocation and storage in woody plant roots. HortScience. 25 (3), 274-281 (1990).
- Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiology. , (2016).
- Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Herrero, M. Ovary starch reserves and flower development in apricot (Prunus armeniaca). Physiologia Plantarum. 108 (1), 35-41 (2000).
- Julian, C., Rodrigo, J., Herrero, M. Stamen development and winter dormancy in apricot (Prunus armeniaca). Annals of Botany. 108 (4), 617-625 (2011).
- Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Pistil starch reserves at anthesis correlate with final flower fate in avocado (Persea americana). PLoS One. 8 (10), e78467 (2013).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C. Quantification of starch in plant tissues. Nature Protocols. 1 (3), 1342-1345 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological Imaging Software Tools. Nature Methods. 9 (7), (2013).
- Rodrigo, J., Herrero, M. Influence of intraovular reserves on ovule fate in apricot (Prunus armeniaca L.). Sexual Plant Reproduction. 11, 86-93 (1998).
- Zhou, J., Spallek, T., Faulkner, C., Robatzek, S. CalloseMeasurer: A novel software solution to measure callose deposition and recognise spreading callose patterns. Plant Methods. 8 (1), (2012).
- Faulkner, C., et al. An automated quantitative image analysis tool for the identification of microtubule patterns in plants. Traffic. 18 (10), 683-693 (2017).
- Kuhn, B. F. Determination of starch in ovules of the sour cherry cv. "Stevnsbaer.". European Journal of Horticultural Science. 71 (3), 120-124 (2006).
- Johansen, D. A. . Plant microtechnique. , (1940).
- Ruzin, S. E. . Plant microtechnique and microscopy. , (1999).
- Rodrigo, J., Rivas, E., Herrero, M. Starch determination in plant tissues using a computerized image analysis system. Physiologia Plantarum. 99 (1), 105-110 (1997).
- Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Ovary starch reserves and pistil development in avocado (Persea americana). Physiologia Plantarum. 140 (4), 395-404 (2010).
- Suarez, C., Castro, A. J., Rapoport, H. F., Rodriguez-García, M. I. Morphological, histological and ultrastructural changes in the olive pistil during flowering. Sexual Plant Reproduction. 25, 133-146 (2012).
- Lang, G. A., Early, J. D., Martin, G. C., Darnell, R. L. Endodormancy, paradormancy, and ecodormancy – Physiological terminology and classification for dormancy research. HortScience. 22 (3), 371-377 (1987).
- Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount clearing and staining of arabidopsis flower organs and siliques. Journal of Visualized Experiments. 2018 (134), 1-10 (2018).
- Kaufmann, H., Blanke, M. Changes in carbohydrate levels and relative water content (RWC) to distinguish dormancy phases in sweet cherry. Journal of Plant Physiology. 218 (July), 1-5 (2017).
- Herrero, M., Dickinson, H. G. Pollen-pistil incompatibility in Petunia hybrida: changes in the pistil following compatible and incompatible intraspecific crosses. Journal of Cell Science. 36, 1-18 (1979).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
