Vastleggen en identificatie van RNA-bindende proteïnen met behulp van klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vangen (CARIC) strategie
Summary
Een gedetailleerd protocol voor de toepassing van de klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vastleggen (CARIC) strategie ter identificatie van eiwitten bindende naar beide taalcode-instellingen en noncoding RNAs wordt gepresenteerd.
Abstract
Een uitgebreide identificatie van RNA-bindende proteïnen (RBPs) is de sleutel tot het begrijpen van de posttranscriptional regelgevende netwerk in cellen. Een veel gebruikte strategie voor het vastleggen van RBP exploiteert de polyadenylatie [poly(A)] van doel de RNAs, die meestal op eukaryotische volwassen mRNAs optreedt, meeste bindende proteïnen van non-poly(A) RNAs ongeïdentificeerde verlaten. Hier beschrijven we de gedetailleerde procedures van een onlangs gerapporteerde methode genoemd Klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vangst (CARIC), waarmee de transcriptome bestrijkende inname van zowel poly(A) als non-poly(A) RBPs door het combineren van de metabole etikettering van RNAs, in vivo UV dwarsbinding, en bioorthogonal coderen.
Introduction
Het menselijk genoom is omgezet in de verschillende soorten codering en noncoding RNAs (ncRNAs), met inbegrip van mRNAs, rRNAs, tRNAs, kleine nucleaire RNAs (snRNAs), kleine nucleolar RNAs (snoRNAs) en lang niet-coderende RNAs (lncRNAs)1. De meeste van deze RNAs bezitten kleding van RBPs en fungeren als ribonucleoprotein deeltjes (RNPs)2. Een uitgebreide omschrijving van de RBPs is daarom een noodzakelijke voorwaarde voor een goed begrip van het regelgevende netwerk tussen RNAs en RBPs, die is betrokken bij verschillende ziekten bij de mens3,–4,5.
De afgelopen jaren getuige geweest van een geweldige impuls van RBPs ontdekt in diverse eukaryotic systemen2,6, met inbegrip van menselijke7,8,9,10,11, muis12,13,14, gist9,15,16, zebravis17, Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,21,22, en menselijke parasieten23,24,25 . Deze voorschotten hebben bevorderd door een RBP vangen strategie ontwikkeld door Castello et al. 7 en Baltz et al. 8 in 2012, die combineert in vivo UV cross-linking van RNA haar interacterende eiwitten, oligo(dT) van poly(A) RNAs en vastleggen massaspectrometrie (MS)-gebaseerd proteomic profilering. Gezien het feit dat poly(A) meestal op volwassen mRNAs, die goed zijn voor slechts ~ 3-5% van de eukaryote transcriptome26, bestaat is deze gebruikte strategie echter niet geschikt voor het vastleggen van de RBPs interactie met non-poly(A) RNAs, met inbegrip van de meeste ncRNAs en pre-mRNAs.
Wij rapporteren hier, de gedetailleerde procedures van een onlangs ontwikkelde strategie voor de vangst van de transcriptome bestrijkende van zowel poly(A) als non-poly(A) RBPs27. CARIC genoemd, deze strategie combineert in vivo UV dwarsbinding en metabole labelen van RNAs met photoactivatable en “aanklikbaar” nucleoside-analogen (die bevatten een bioorthogonal functionele groep die klik reactie kan deelnemen), 4 – thiouridine (4SU), en 5-ethynyluridine (EU). Stappen die zijn de sleutel tot het ideale resultaten met de CARIC strategie zijn efficiënte metabole labeling, UV-dwarsbinding en klik op reactie en de handhaving van de integriteit van het RNA. Omdat Cu(I) gebruikt als de katalysator in Klik op reactie leiden de versnippering van de RNAs tot kan, is een Cu(I) ligand die RNA fragmentatie verminderen kan is essentieel. We beschrijven hoe u efficiënt Klik reacties in cel lysates zonder ernstige achteruitgang van RNA veroorzaakt.
Hoewel RBP vangen en identificatie in HeLa cellen alleen in dit protocol wordt beschreven, kan de CARIC strategie tot verschillende celtypes, en eventueel aan levende organismen worden toegepast. Naast RBP vastleggen bevat dit protocol ook gestroomlijnde stapsgewijze procedures voor de bereiding van de monsters van de MS en eiwit identificatie en kwantificering, die kan nuttig zijn voor degenen die niet vertrouwd zijn met proteomic experimenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De handhaving van eerlijke RNA integriteit is een van de sleutels tot succesvolle CARIC experimenten. Met passende liganden van Cu(I) en zorgvuldige bewerking, kan aantasting van het RNA aanzienlijk worden verkleind, hoewel gedeeltelijke afbraak was waargenomen. De verhoudingen van de vervanging van de EU en 4SU in experimentele monsters zijn respectievelijk 1,18 procent en 0,46%, (gegevens niet worden weergegeven). Voor intact RNAs met een lengte van 2.000 nt, ~ 90% van de RNAs bevatten ten minste één EU en één 4SU….
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door de nationale Natural Science Foundation van China subsidies 91753206, 21425204, en 21521003 en door de nationale sleutel onderzoeks- en ontwikkelingsproject 2016YFA0501500.
Materials
| HeLa | ATCC | ||
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Penicillin & Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| EU (5-ethynyl uridine) | Wuhu Huaren Co. | CAS:69075-42-9 | |
| 4SU (4-thiouridine) | Sigma Aldrich | T4509 | |
| 10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| UV cross-linker | UVP | CL-1000 | Equiped with 365-nm UV lamp |
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma Aldrich | D5758 | To treat water. Highly toxic! |
| Tris·HCl, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | 62476 | |
| Nonidet P-40 | Biodee | 74385 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 88265 | One tablet for 50 mL lysis buffer. |
| LDS (Lithium dodecyl sulfate) | Sigma Aldrich | L9781 | |
| 15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) | Millipore | UFC901024 | |
| 0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) | Millipore | UFC501096 | |
| Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88816 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | 41639 | |
| Azide-biotin | Click Chemistry Tools | AZ104 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | |
| THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] | Sigma Aldrich | 762342 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Azide-Cy5 | Click Chemistry Tools | AZ118 | |
| LDS sample buffer (4×) | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
| 10% bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0301BOX | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | R6513 | |
| SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] | J&K | 315442 | |
| Triethanolamine | Sigma Aldrich | V900257 | |
| Streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20353 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma Aldrich | 61743 | |
| Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | 30970 | |
| MaxQuant | Version: 1.5.5.1 |
Referencias
- Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
- Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. RNA-binding proteins in Mendelian disease. Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).
- Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive. Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).
- Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. Identifying proteins that bind to specific RNAs – focus on simple repeat expansion diseases. Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).
- Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).
- Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).
- Castello, A., et al. Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells. Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
- Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).
- Liepelt, A., et al. Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).
- Liao, Y., et al. The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease. Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).
- Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).
- Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).
- Despic, V., et al. Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition. Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).
- Wessels, H. H., et al. The mRNA-bound proteome of the early fly embryo. Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).
- Sysoev, V. O., et al. Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila. Nature Communications. 7, 12128 (2016).
- Reichel, M., et al. In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings. Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).
- Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).
- Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12, 42-53 (2016).
- Bunnik, E. M., et al. The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 17, 147-164 (2016).
- Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome. Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).
- Nandan, D., et al. Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture. PLoS ONE. 12 (1), e0170068 (2017).
- Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
- Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
- Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics. ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).
- Curanovic, D., et al. Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap. Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).
- Zheng, Y. X., Beal, P. A. Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).
- Nainar, S., et al. Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA. ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).
- Bao, X., et al. Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).
- Holmqvist, E., Vogel, J. RNA-binding proteins in bacteria. Nature Reviews Microbiology. , (2018).
